[发明专利]诱导多能干细胞体外定向分化成晶状体小体的方法

权利要求书

1.一种诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，包括以下步骤：

（1）将多能干细胞定向诱导分化成初级神经外胚层细胞团

将多能干细胞接种到基质胶溶液包被的六孔板上，用含人生长因子noggin的mTesR培养液培养5-7天后形成初级神经外胚层细胞团；所述基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成, 胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8-1.2%；

（2）分离挑选初级神经外胚层细胞团

用乙二胺四乙酸溶液消化初级神经外胚层细胞团，然后用机械法将初级神经外胚层细胞团周边的数层神经外胚层细胞挑出；

（3）诱导神经外胚层细胞定向分化为初级晶状体小体

将挑出的神经外胚层细胞团接种到新的基质胶溶液包被的六孔板中，用含人生长因子bFGF、BMP4、BMP7的mTesR培养液培养5-7天并且每日更换培养液，保留出现“荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其余细胞团剔除，继续培养8-10天后即可获得初级晶状体小体；所述新的基质胶溶液由胚胎干细胞基质胶溶解在DMEM/F12培养液后形成，胚胎干细胞基质胶的体积比例为0.8-1.2%；

（4）诱导初级晶状体小体分化为成熟的晶状体小体

用含人生长因子bFGF、Wnt3a的mTesR培养液培养初级晶状体小体，并且每日更换mTesR培养液，9-11天后即可获得由囊膜、晶状体上皮细胞、晶状体初级纤维细胞及晶状体成熟纤维细胞构成的晶状体小体；

所述步骤（1）中，mTesR培养液中含有90-110ng/ml的人生长因子noggin；

所述步骤（2）中挑出的神经外胚层细胞团为5-10层的内层细胞、3-7层的中层细胞以及3-7层的外层细胞；

所述步骤（3）“荷包蛋样”细胞排列结构的神经外胚层细胞团，其结构为外层数十层分化的上皮样细胞，细胞体积较中央区细胞明显增大，胞质多，细胞排列相对疏松，中央区细胞体积小排列紧凑，胞质少，两类细胞相接形成类似荷包蛋的结构；该“荷包蛋样” 的中央区细胞团较厚、周边为相连的裙边状。

2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的乙二胺四乙酸溶液，是在PBS中加入乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸含量为0.4-0.6mM，并且加入氯化钠使乙二胺四乙酸溶液的渗透压为320-360mOsm。

3.根据权利要求2所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，mTesR培养液中含有17-23ng/ml的BMP4、17-23ng/ml 的BMP7、80-120ng/ml的bFGF；所述步骤（4）中，mTesR培养液中含有17-23ng/ml的Wnt3a以及80-120ng/ml的bFGF。

4.根据权利要求3所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于所述的晶状体小体呈现透明的3D结构，为圆形或椭圆形，直径1-3mm，表达晶状体特异性蛋白包括α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白以及水通道蛋白MIP。

5.根据权利要求4所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于所述的α-A、α-B、β、γ四种晶状体蛋白为晶状体纤维细胞的结构蛋白，水通道蛋白MIP为表达在晶状体上皮细胞以及晶状体纤维细胞细胞膜上的通道蛋白。

6.根据权利要求5所述的诱导多能干细胞定向分化成晶状体小体的方法，其特征在于所述的囊膜为晶状体外层包绕的一层透明薄膜，晶状体上皮细胞为囊膜下的仅有的一层柱状或立方状上皮细胞，初级晶状体纤维细胞为部分细胞器细胞核开始退化的由晶状体上皮细胞分化而来的纤维细胞，成熟晶状体纤维细胞为胞内细胞器细胞核完全退化由初级晶状体纤维细胞分化而来的细胞。

7.权利要求1所述方法获得的晶状体小体，用于晶状体胚胎发育机制的研究、先天性白内障发病机制的研究以及白内障相关药物筛选。