[发明专利]一种检测3D类器官中P-gp介导的Rh123转运的方法及应用

说明书

本发明涉及一种检测3D类器官中p‑糖蛋白(P‑glycoprotein,P‑gp)介导的罗丹明123(Rh123)转运的方法及其在筛选P‑gp的抑制剂中的应用。首先对C57BL/6小鼠的小肠隐窝进行分选，接种到含有基质胶的培养皿中，并在Advanced DMEM/F12培养基中培养，形成3D类器官。然后利用该3D类器官模型定性定量检测P‑gp介导的Rh123的转运及P‑gp的抑制剂维拉帕米(Verapamil)对Rh123转运的影响，具体包括3D类器官分别与①P‑gp的底物Rh123②Rh123和Verapamil共孵育，使用超声破碎法释放3D类器官中的Rh123，最后在多功能酶标仪上对Rh123的浓度进行检测。该方法具有简便、快速、灵敏度高的优点，可结合3D类器官模型开展P‑gp介导的药物转运的研究，也可进行P‑gp抑制剂体外筛选的研究。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测3D类器官中P-gp介导的Rh123转运的方法及其在筛选P-gp抑制剂中的应用。

背景技术

目前在临床上，口服给药是最常见的给药方式，而且相对于静脉等其他的给药方式，具有相对安全和方便的优点。药物进入机体内，一般要经过吸收、分布、代谢和排泄的过程，对于口服药物来说，其在小肠的吸收最为重要，因为这是药物在机体内发挥药效的前提。有研究表明，在新药研发过程中，大约40％的先导化合物在临床阶段被否决的最常见原因包括了药动学性质不理想，尤其是口服后吸收性较差，造成药物的生物利用度太低。因此，在化合物筛选的早期阶段，不仅要关注化合物的活性，也要对其药动学性质进行合理的评估，以期减少后期研究的投入和降低失败的风险。其中，基于p-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)转运体介导的药物筛选及药物吸收与外排的研究在新药研发中占有重要的地位。

P-gp是腺苷三磷酸(ATP)依赖性药物外排转运体，属于ATP结合盒(ATP bindingcassette,ABC)转运体家族中最大的一个亚型，亦是最重要的亚型之一。1976年，Juliano等人首次在秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现了高分子质量(170kD)的细胞膜糖蛋白，并因其表达水平与细胞膜的通透性、细胞内的药物浓度以及细胞耐药程度有关而将其命名为P-gp。研究发现，P-gp在小肠粘膜的上皮细胞等正常的组织和细胞中也有表达。机体出于对自身的保护，药物等外来的有害物质在小肠的吸收就会受到限制，这也是造成口服药物在体内生物利用度降低的原因之一，进而影响了药效的发挥。因此，P-gp在药代动力学，特别是在药物的吸收与外排的过程中发挥着重要的作用。另外，P-gp在肿瘤细胞中的过度表达限制了抗肿瘤药物的摄取，是造成肿瘤细胞多药耐药(Multidrug resistance,MDR)现象产生的重要原因。

随着技术的发展及科研的需要，多种利用体外模型来模拟人的小肠上皮，并进行P-gp介导的药物转运的研究相继被报道。其中，基于人的结肠癌细胞系(caco-2)建立的细胞单层转运模型是国内外应用最广泛的模型。在转运小室(Transwell)的碳酸聚酯膜上培养caco-2细胞，通过细胞之间的紧密连接形成具有极性的细胞单层，可用于研究P-gp底物的吸收与外排。虽然该模型被视为体外研究药物转运的标准，但是，其存在的一些局限性依然不能被忽视。例如，caco-2肿瘤细胞在生理和形态上与正常的小肠上皮细胞有很大的差别；而且，细胞的培养条件和代数会对模型的稳定性造成影响；另外，培养周期(21天)过长也是高通量筛选的一个制约因素。因此，非常有必要建立一种全新的体外研究P-gp介导的药物转运的模型。

2009年，Toshiro Sato等人报道了在体外利用单个小肠隐窝可以分化形成绒毛状的上皮结构。小肠隐窝中存在的干细胞在适宜的条件下具有分化再生功能，在基质胶中可以形成一个三维的球状类器官(organoid)结构，因此称之为3D类器官。3D类器官中新形成的隐窝向外侧突起，内侧形成了绒毛状的结构，相比于caco-2细胞转运模型，3D类器官是由正常的小肠干细胞分化而来，因此其在生理上与小肠上皮更为相似。而且，P-gp在3D类器官中的表达的位置与表达量与其在小肠中的表达没有明显差异。另外，培养周期短(3-5天)也为P-gp介导的药物转运的筛选节约了时间和经济成本。