[发明专利]重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白，所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的是通过大肠杆菌表达系统进行原核表达和纯化得到，所述大肠杆菌表达系统为大肠杆菌BL21。

2.如权利要求1所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法，包括ESAT6-CFP10融合蛋白表达菌株的构建以及ESAT6-CFP10融合蛋白的表达与纯化，所述ESAT6-CFP10融合蛋白表达菌株的构建包括：（1）基因ESAT6和基因CFP10的引物设计、合成及扩增；（2）pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒的构建；（3）大肠杆菌BL21的转化。

3.如权利要求2所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，基因ESAT6的上游引物序列为SEQ ID NO.3，基因ESAT6的下游引物序列为SEQID NO.4；基因CFP10的上游引物序列为SEQ ID NO.5，基因CFP10的下游引物序列为SEQ IDNO.6。

4.如权利要求2所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（2）pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒的构建是先以pET-30a质粒和ESAT6基因构建pET-30a-ESAT6重组质粒，再以pET-30a-ESAT6重组质粒和CFP10基因构建pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒。

5.如权利要求4所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述以pET-30a质粒和ESAT6基因构建pET-30a-ESAT6重组质粒的方法为：用KpnⅠ及NdeⅠ限制性内切酶分别对pET-30a质粒和ESAT6基因进行双酶切，回收双酶切产物并置于PCR仪上，16℃，连接2小时，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取单克隆菌落进行PCR鉴定和重组质粒的测序分析，确定阳性克隆；所述以pET-30a-ESAT6重组质粒和CFP10基因构建pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒的方法为：用KpnⅠ及EcoRⅠ限制性内切酶分别对pET-30a-ESAT6重组质粒和CFP10基因进行双酶切，回收双酶切产物并置于PCR仪上，16℃，连接2.5小时，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取单克隆菌落进行PCR鉴定和重组质粒的测序分析，确定阳性克隆。

6.如权利要求2所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法，其特征在于，ESAT6-CFP10融合蛋白的表达与纯化是通过IPTG诱导表达重组大肠杆菌，菌体破碎离心后上清液通过SOURCE 30Q离子交换柱层析进行纯化，并对纯化后的蛋白进行相关鉴定和分析。

7.如权利要求2所述重组结核杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（3）大肠杆菌BL21的转化是将pET-30a-ESAT6-CFP10重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，经PCR、测序筛选阳性转化子。