[发明专利]一种水稻Wax-mq基因型的ARMS-Tm-shift-qPCR检测试剂和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水稻Wax-mq基因型的ARMS-Tm-shift-qPCR检测试剂和检测方法；属于生物检测技术领域。

背景技术

近年来,随着人民生活水平的提高,消费者对稻米食味品质的要求也越来越高。研究表明，直链淀粉含量是决定米饭质地和食味品质的重要因素，低直链淀粉含量的水稻其米饭表面光泽透亮，综合了糯米的柔软性和粳米的弹性,适口性好，食味品质佳，备有较高的商品性。目前已知水稻中可供育种利用的低直链淀粉含量突变基因有14个，其中水稻低直链淀粉基因Wax-mq是通过化学诱变剂N-甲基-N-亚硝基脲处理日本水稻品种越光而获得的低直链淀粉含量变异基因，该基因在腊质基因(Wax)编码区发生了两个碱基的替换,进而影响Wax蛋白的活性,造成其直链淀粉含量的降低，序列分析表明，与来自野生型亲本越光中的Wax-mq基因相比，在编码区发生了2个碱基的替换，其中497位的G突变为A，595位的T突变为C，从而使相应的氨基酸序列产生了2个错义突变，即位于第4外显子的精氨酸和第5外显子的色氨酸均突变为组氨酸，推测这2个错义突变是造成直链淀粉含量下降的原因。Sato等针对Wax-mq基因第497位单核苷酸变异设计了能区分Wax-mq基因型的显性PCR标记，该标记能准确鉴定水稻中是否含有Wax-mq基因，但不能有效区别Wax-mq的纯合和杂合基因型；Hen等根据该突变位点重新设计了能准确区分三种基因型的CAPS标记，Ye等利用四引物扩增受阻突变体系进行等位基因特异扩增来检测水稻低直链淀粉含量基因，但是由于检测过程中涉及到限制性内切酶的使用或者需要PCR扩增和凝胶电泳等多个程序，因此，在实际应用中存在操作烦琐,PCR产物污染，费用昂贵等弊端。

近年来，单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism,SNP)作为一种遗传标志在动植物遗传学和基因工程的研究中发挥了重要作用。目前用于SNP检测的技术方法有多种，包括限制性片段长度多态性检测(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、高分辨率熔解曲线法(High-resolutionmelting,HRM)、质谱法(Massspectrometry)、TaqMan探针法、DNA测序、基因芯片等。然而，每种方法都存在一定的适用范围。多数检测方法因为通量的限制，难以满足大样本多基因的研究要求；全基因组芯片技术又因其昂贵的费用，不适用于大部分的实验室研究。因此,寻找一种通量灵活、准确可靠,且能高性价比地完成基因分型的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速检测水稻低直链淀粉基因Wax-mq基因第497位的单核苷酸多态性的方法及所用试剂。本发明以SYBRGreenⅠ荧光染料为指示剂，建立了能检测Wax-mq基因第497位单核苷酸多态性（能同时区分Wax-mq基因第497位的GG纯合、AA纯合及GA杂合三种基因型）的实时荧光PCR基因分型体系；能实现快速、高效、精确的检测，在苗期就可完成Wax-mq基因型的鉴定，从而提高了育种工作的预见性和可操作性。

技术方案

一种水稻Wax-mq基因型的ARMS-Tm-shift-qPCR检测试剂，包含：

引物Wax-mqW：5'CGCCCGTCCCGCCGGTTTTTCCATTGCTACAATCG3'，如SEQIDNO.1所示；

引物Wax-mqM：5'GATTACCGGTTTTTCCATTGCTACAAACA3'，如SEQIDNO.2所示；

引物Wax-mqR4：5'GCGAAAGGTAAACTAATGATGACTCCAC3'，如SEQIDNO.3所示。

上述水稻Wax-mq基因型的ARMS-Tm-shift-qPCR检测试剂，包含SYBRGreenⅠ荧光染料。

上述水稻Wax-mq基因型的ARMS-Tm-shift-qPCR检测试剂，还包含荧光定量PCR所用必需的其他试剂；这些试剂是本领域技术人员公知的。

一种水稻Wax-mq基因型的ARMS-Tm-shift-qPCR检测方法，以待测样品体细胞内的DNA作为模板，用以下引物进行荧光定量PCR反应；

当shift-ARMS引物管的熔解曲线为单峰且Tm值为83℃（+0.5），有单一扩增曲线并且其ct<35，说明该样本结果判断为野生型；