[发明专利]测定人POT1基因rs10250202位点多态性的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及测定单核苷酸多态性的方法。

背景技术

SNP(单核苷酸多态性)是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基的置换、插入和缺失等形式。基因多态性是个体与生俱来的遗传特征，不随环境发生变化，也不是某种疾病特异或者非特异的临床表现，因此其应用并不存在诊断和治疗作用。

基因多态性检测在遗传学领域和医学领域中应用广泛，举例如下：1.研究物种起源和进化等遗传学现象。根据基因变异情况，获得生物大分子的信息，推断生物进化历史，阐明物种进化关系。应用于考古学中以确定古人类遗传变异特征以及不同种群的亲缘关系。2.研究多态与种群亲缘关系等遗传学研究。多态亦与各种人体特征密切相关，包括身高、体重、肤色、相貌特征等等。3.在预防医学领域可以用于疾病预防措施。通过研究人体对毒物的耐受性，发现易于对某种毒物发生毒性作用的个体，及时避免该个体与毒物接触，保护该易感人群。例如，对准备从事接触苯等有机溶剂的人群进行多态检测，筛查出容易出现血液毒性、神经毒性等反应的个体，令其远离苯等有机溶剂，保护此类易感人群免受毒物侵害。4.药理学中可以用于药物选择以及剂量确定。通过多态检测可以判断患病个体对某种药物毒副作用敏感，从而避免使用此种药物以免除其毒性作用。通过判断个体对药物效果的反应程度确定药物剂量，减少药物用量及其副作用。

端粒相关基因在保护端粒结构的完整性方面发挥着重要的作用。端粒保护蛋白1(protectionoftelomeres1,POT1)通过结合端粒末端的单链3’悬突来稳定端粒结构，达到保护染色体末端的作用。POT1基因rs10250202位点多态，在人群中存在两种等位基因A和C，形成三种POT1基因的基因型：AA型(人体基因组rs10250202多态位点的两个等位基因碱基均为A)，AC型(人体基因组rs10250202多态位点的两个等位基因碱基分别为A和C)和CC型(人体基因组rs10250202多态位点的两个等位基因碱基均为C)。

聚合酶链式反应-限制性片断长度多态(PCR—RFLP)技术是一种快速、简便、准确、低成本测定SNP(单核苷酸多态性)基因型的经典方法。该方法通过引物来对模板进行扩增反应，形成足够数量和稳定的扩增产物，通过对扩增产物的酶切和检测酶切产物的片段长度，最终测定出SNP。POT1基因rs10250202多态位点采取PCR—RFLP技术进行检测，所需内切酶为DpnII、MboI、Sau3AI、BfuCI等，其价格较昂贵，因此需要开发新的检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种非疾病诊断或治疗目的用的测定人POT1基因rs10250202位点多态性的可靠手段。

根据本发明的第一方面，提供了一种测定人POT1基因rs10250202位点多态性的方法，包括：

提供待测人基因组DNA；

提供扩增人POT1基因rs10250202位点附近序列的上游引物和下游引物，其中上游引物具有错配碱基T；

以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以获得含TGATMA片段的扩增产物，其中M为人POT1基因rs10250202位点上的待定碱基A或C；

提供限制性内切酶；

利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切(反应)以获得相应的酶切产物；以及

根据所得酶切产物来确定人POT1基因rs10250202位点上的待定碱基M是A还是C，其中，限制性内切酶为仅能够切开TGATCA片段与TGATAA片段之一的限制性内切酶。

根据本发明的实施例，在所得扩增产物上，上游引物的错配碱基T与M之间相隔三个碱基GAT。令人惊讶的是，如此设置错配碱基将使酶切反应进行得极其顺利，不会出现酶切不充分等现象。并且，如此设置上游引物错配碱基使PCR反应进行顺利，提高了PCR的灵敏度和特异度，这可能与错配碱基后使得扩增序列的二级结构改变有关。

在本发明的一个可选实施例中，在所得扩增产物上，上游引物末端碱基与M相邻。

在本发明的一个优选实施例中，在所得扩增产物上，上游引物末端碱基不与M相邻。例如，上游引物末端可以是……TGA、……TG等结构。难以想象，具有这种设计的上游引物竟然会进一步大大促进酶切反应，这可能与扩增结合力有某种关联。

在本发明的一个优选实施例中，限制性内切酶可以采用仅能切开TGATCA片段的BclI或其同裂酶。这类BclI酶价格低廉，能大大降低测定成本。