[发明专利]促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液及方法

说明书

本发明公开了促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液及方法。所述培养液为含蛋白终浓度50‑200μg/ml的条件培养基、10％FBS的DMEM/F12培养液，条件培养基为培养过牙周膜间充质干细胞的培养液。所述方法为：取P1‑P5代的牙周膜间充质干细胞加入含10％FBS的DMEM/F12培养液于37℃、5％CO₂条件下培养，待细胞汇合度达到80‑90％时，换成促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液继续培养12‑48h。本发明中条件培养基含牙周膜间充质干细胞本身分泌的多种细胞因子，对细胞无毒副作用，没有引入外源性物质，安全性较高，降成本低，具有更好的抗炎效果，能够促进抗炎因子的大量分泌。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其涉及促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液及方法。

背景技术

牙周病是人类最常见的口腔感染性疾病，其患病率较高，被列为糖尿病的第六大并发症，牙周组织的炎症尤其牙周炎被认为是某些全身疾病的危险因素。在现有的牙周病治疗过程中，多是单纯的应用牙周膜间充质干细胞或者是中药组合物治疗。牙周膜干细胞是存在于牙周组织的干细胞，其具有间充质干细胞的特性，包括多向分化潜能、明显的高增殖活性及克隆形成能力，体外可分化为成脂成骨细胞，体内可分化为牙骨质样和牙周膜样组织，是牙周支持组织再生和重建的基础，是理想的组织工程细胞。但是，单纯应用牙周膜间充质干细胞或者重要组合物治疗，无法获得预期的良好效果，同时有可能产生反作用。

随着对牙周病机制的深入研究发现，牙周病的大多数组织损伤是由于宿主的免疫应答引起的，降低宿主的免疫应答可能会降低或减缓牙周病发展过程中的牙周组织损伤，促进牙周组织的再生。牙周炎症部位存在大量的抗炎因子，如TSG-6(肿瘤坏死因子-α刺激基因-6)和STC-1等，抗炎因子可以通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答，使机体恢复健康状态。因此，促进牙周炎症部位抗炎因子的分泌，可能会更有利于牙周病的治疗。现在一般使用骨髓间充质干细胞或3D培养来促进牙周炎症部位抗炎因子的分泌，但是这些方法存在来源受限制、费用较高、操作步骤复杂或效果不理想等缺陷。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液及方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液，为含蛋白终浓度50-200μg/ml的条件培养基、10％FBS的DMEM/F12培养液，条件培养基为培养过牙周膜间充质干细胞的培养液。

优选地，所述促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液为含蛋白终浓度100μg/ml的条件培养基、10％FBS的DMEM/F12培养液。

所述条件培养基的制备方法，包括以下步骤：

取P1-P5代牙周膜间充质干细胞，采用含10％FBS的DMEM/F12培养液置于37℃、5％CO₂条件下培养，当汇合度达到80-90％时，换成无酚红DMEM培养基，继续培养48-72h后，收集细胞培养上清；浓缩收集的上清得到条件培养基。

优选地，浓缩后条件培养基蛋白浓度为2-5mg/ml。

优选地，采用P2或P3代牙周膜间充质干细胞培养制备条件培养基。

优选地，换成无酚红DMEM培养基后，继续培养60-72h。

本发明还提供一种促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的方法，包括以下步骤：

取P1-P5代的牙周膜间充质干细胞加入含10％FBS的DMEM/F12培养液置于37℃、5％CO₂条件下培养，待细胞汇合度达到80-90％时，换成上述促牙周膜间充质干细胞分泌抗炎因子的培养液继续培养12-48h。