[发明专利]一种焦测序定量检测甲基化的方法

权利要求书

1.一种非诊断为目的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：步骤包括：1）DNA提取；2）亚硫酸氢盐处理；3）PCR扩增；4）测序；5）关联分析；

所述步骤4）的测序方法为：按照特定两核苷酸、dGTP加入方式进行焦测序；其中，两核苷酸测定序列反应得到合成数目的编码信息，dGTP测定序列反应得到合成数目信息；

所述步骤4）的具体方法包括以下步骤：

4-1）制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰的DNA链固定到所述磁珠上，在0.05-0.2 M NaOH溶液下变性；将未固定的另一条DNA链清除；然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板；

4-2）测序引物杂交：将测序引物与所述单链DNA模板在杂交反应体系中，70-80°C下放置5-10 min，自然冷却至室温，完成杂交；

4-3）测序：配备测序反应体系，与所述步骤4-2）得到的杂交产物混合，焦测序反按照特定两核苷酸、dGTP加入方式进行；

所述步骤4-2）中，所述测序引物是一段与单链DNA模板完全互补的序列；

所述步骤4）中，两核苷酸每个测序反应获得两核苷酸合成测序的信号强度信息，dGTP每个测序反应获得单个核苷酸合成测序的信号强度信息，所述测序信号强度与合成核苷酸数目成正比，即每个测序反应的测序信号强度均可以转化为核苷酸合成的数目；

所述步骤5）中，根据焦测序得到的dGTP每个测序反应获得的核苷酸合成的数目信息，该数目信息是包为0≤xi≤1；

所述关联分析为：假定一个GC位点中C被甲基化的程度为xi，其中0≤xi≤1，那么，在经过亚硫酸氢盐处理的PCR产物这个碱基序列中，含有“C”的DNA模板序列含量为xi，而含有由这个碱基未被甲基化转化而来的“T”DNA模板序列含量则为(1-xi)；根据dGTP测序反应得到的核苷酸合成的数目信息，即可求出xi的数值；

所述特定两核苷酸是依据DNA模板分析片段确定的，包括(dCTP+dTTP)、(dATPαS+dCTP)、(dATPαS+dTTP)。

2.根据权利要求1所述的非诊断为目的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所述步骤2）中，采用传统的亚硫酸氢盐转化方法，或者采用市售的试剂盒、按照其操作流程实施。

3.根据权利要求1所述的非诊断为目的焦测序定量检测甲基化的方法，其特征在于：所述步骤3）中，PCR扩增所用的PCR一条引物为5’端被生物素、氨基或者丙烯酰胺基团修饰，与表面修饰链霉亲合素、羧基的固相载体反应，或者与丙烯酰胺单体聚合反应制备单链DNA模板。