[发明专利]人偏肺病毒多表位抗原及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及人偏肺病毒B细胞、T细胞多表位抗原，属于基因工程领域，依据人偏肺病毒B细胞表位、CTL细胞表位和Th细胞表位基因片段的制备、串联及表达，制备人偏肺病毒多表位抗原，并评价其激活细胞免疫和体液免疫应答水平。

背景技术

人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)是荷兰学者于2001年从呼吸道感染的婴幼儿标本中分离到的一种新现病毒，其属于副粘病毒科肺病毒亚科偏肺病毒属。hMPV为有包膜的单负链RNA病毒，基因组含有8个基因编码9种不同蛋白，分别是核衣壳蛋白(N)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、转录延伸因子(M2-1)、RNA合成调节因子(M2-2)、小疏水蛋白(SH)、主要黏附蛋白(G)、和RNA聚合酶大亚单位(L)。从3’至5’端分别是3’-N-PM-F-M2-1-M2-2-SH-G-L-5’。种系发生分析表明，HMPV可分为A、B两个基因型。A、B两个型别又可根据黏附蛋白G和融合蛋白F基因序列分别分为A1、A2和B1、B2两个亚型。除G蛋白外，hMPV其它蛋白均高度保守。

研究证实，hMPV是仅次于呼吸道合胞病毒的引起儿童急性呼吸道感染的第二位病毒病原，其也是老年人、免疫缺陷患者及有基础疾病人群急性呼吸道感染的重要病原体。hMPV不能引起感染后持久免疫，可反复感染。

目前尚缺乏抗hMPV的有效药物和疫苗。研究表明hMPV甲醛灭活疫苗免疫动物后能使再次感染时疾病加重。表位疫苗具有安全、无毒、稳定、容易生产、可根据需要组合等优点，而成为最具开发前景的新型疫苗之一。一个理想的病毒疫苗不仅要能激发体液免疫，产生特异性的中和抗体，还应该能激活CD8+细胞毒性T细胞(CTL)免疫来清除病毒。而CD4+辅助性T细胞(Th)既参与细胞免疫(Th1细胞)，有利于机体胞内病原体的清除，也有重要的辅助抗体产生的作用(Th2细胞)。为发挥更好的抗病毒作用，T/B细胞联合表位可能更为合理和有效。目前尚未见将hMPV B细胞表位和CTL、Th表位修饰串联构建为多表位抗原，评价其免疫应答的报道。

常用的表位筛选方法有化学或生物法、肽探针扫描技术、随机肽库技术及人工预测法等。前三者有操作繁琐，工作量大，耗时长，成本高，特异性抗体制备困难等缺点，使用受到一定的限制。生物信息学技术的发展，为多表位疫苗的快速发展奠定了基础。近年来，研究者开发了大量的算法和软件来进行T和B细胞表位的预测，有效性及准确率等方面有了很大提高。许多免费的在线软件为研究者的应用提供了方便，每种软件的预测都有其局限性，将多种计算方法和软件综合运用，可使抗原表位预测的有效性和准确率大大提高。

已有诸多研究证实副粘病毒科病毒的F蛋白是主要的保护性抗原，可刺激机体产生保护性中和抗体，且hMPV F蛋白相对保守(A、B型间同源性约为94％)，可对所有型别hMPV有交叉免疫，故F蛋白可作为B细胞表位预测蛋白。因hMPV的L蛋白较大(约2000aa)，不适于表位预测，参照hRSV的研究，P蛋白无CTL表位，故hMPV的N、M、F、M2-1、M2-2、SH和G等7个蛋白可进行CTL和Th表位预测。

本发明中3段CTL表位(C1、C2和C3)已有文献报道(Melendi GA,Zavala F,Buchholz UJ,et al.Mapping and characterization of the primary and anamnestic H-2(d)-restricted cytotoxic T-lymphocyte response in mice against human metapneumovirus.Journal of virology,Oct.2007,p.11461-11467；Herd KA,Mahalingam S,Mackay IM,et al.Cytotoxic T-lymphocyte epitope vaccination protects against human metapneumovirus infection and disease in mice.Journal of virology,Feb.2006,p.2034-2044)，可增强CTL细胞免疫应答，可降低攻毒小鼠肺部病毒载量，并减轻肺部组织病理学改变。本发明将文献报道的CTL表位和自行预测的B细胞表位、CTL表位和Th表位进行串联，既可激活细胞免疫中的CTL免疫和Th免疫，也可激活体液免疫，体外实验对hMPV有一定中和作用。

发明内容