[发明专利]靶向HER2的人源化改造的非内化单链抗体P2h2及应用

说明书

本发明公开了一种靶向HER2的人源化改造的非内化单链抗体P2h2及应用，属于抗肿瘤技术领域。本发明公开的人源化改造的非内化单链抗体P2h2，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；该抗体的获得是将鼠源性单链抗体e23sFv的CDR移植到同源性最高的人抗体共有序列的FR，再选择性地将FR中对维持抗体空间构象的13个重要氨基酸残基突变为e23sFv中的鼠源性氨基酸残基，构建库容量为2¹³单链抗体噬菌体展示库，筛选出1株具有高亲和活性的人源化非内化单链抗体P2h2，为在临床诊断和治疗领域的应用打好基础。

技术领域

本发明属于抗肿瘤技术领域，涉及一种抗人HER2单链抗体，特别涉及一种经人源化改造的非内化抗人HER2单链抗体，包括其氨基酸序列和核苷酸序列以及抗体制备方法和其对HER2阳性肿瘤细胞的诊治用途。

背景技术

HER2(human epidermal growth factor receptor-2，ErbB2/P185)是人表皮生长因子受体(EGFR)家族的第二个成员，由原癌基因erbB2/Her2编码，编码基因定位于人染色体17q21，分子量为185kDa，是一种酪氨酸激酶受体膜糖蛋白。HER2通过与HER1,HER3或HER4形成异二聚体，导致下游MAPK和PI3K等信号通路活化，过度传导生长信号从而导致细胞恶性增殖。在人类多种肿瘤中，包括25-30％乳腺癌、35-45％胰腺癌及90％的结肠直肠癌、16-57％的非小细胞肺癌、9-38％的胃癌等都发现有HER2原癌基因扩增或者蛋白过表达现象，临床上称为HER2阳性肿瘤，主要表现为肿瘤恶性程度高，易进展及转移，对放化疗不敏感，易复发，患者生存期短。

1975年，Kohler与Milstein发明了用来制备单克隆抗体(Monoclonal antibody，mAb)的杂交瘤技术，之后单抗药物迅速发展并应用于临床。近年来，靶向HER2的抗体药物也已经成为HER2阳性肿瘤治疗新热点。曲妥珠单抗(赫塞汀，英文名Trastuzumab/Herceptin)是Genetech公司开发的抗HER2人源化单克隆抗体药物，美国FDA于1998年批准上市，目前曲妥珠单抗联合化疗药物(紫杉醇等)已经成为HER2过表达晚期转移性乳腺癌和晚期胃癌的一线治疗方案，在HER2阳性转移性乳腺癌的治疗中，临床有效率可达38％，欧洲EMEA已经批准Trastuzumab联合化疗药物作为治疗HER2阳性进展期胃癌的一线治疗方案。

尽管Trastuzumab的临床应用取得了令人鼓舞的结果，但仍有大量病人对治疗无反应，或治疗后复发。有研究报道鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，可引起机体免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应，产生人抗鼠抗体(Human anti-mouse antibody，HAMA)反应，重复使用时甚至可导致病人严重的过敏性休克。而且由于HAMA的存在，鼠单抗在人体内会很快得到清除，半衰期很短，因此限制了其临床应用。Trastuzumab为人鼠嵌合抗体，但其可变区部分为鼠源性，会引发人体产生HAMA，有转移性乳腺癌长期应用Trastuzumab治疗的研究报告指出大约有25％的病人出现过心脏毒性；临床Ⅲ期试验结果表明，HER2阳性乳腺癌病人只有大约1/3对Trastuzumab单剂治疗有确切的疗效；在临床，即使联合化疗，大多数病人在使用Trastuzumab治疗一年内就会产生耐药。

随着对各类抗体结构和功能之间关系的深入了解，利用抗体工程技术对抗体结构进行改造，将动物来源的单克隆抗体人源化(Monoclonal humanization)，以降低这些单抗反复应用于人体后产生的免疫原性使之用于人类疾病的治疗，是目前研究的一个热点。抗体人源化改造的主要策略有以下几种：

1.嵌合抗体