[发明专利]一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法

说明书

本发明公开了一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法，将基因组DNA经亚硫酸氢盐转化后的PCR产物进行两核苷酸合成焦测序，连续记录每个测序反应得到包括两核苷酸种类及其核苷酸合成数目的测序编码信息。通过设定已确定的目标区域序列中所有CG位点中碱基C均不同程度的转化成T，再利用两核苷酸合成焦测序得到的信息，进行关联分析，实现目标区域序列中甲基化的定量分析。本发明能够大幅度提高测序长度，拓宽了传统焦测序的分析范围，适合单样本PCR产物、以及混合样本PCR产物序列的甲基化分析。

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种PCR产物序列分析方法，具体涉及一种两核苷酸合成焦测序定量检测甲基化的方法。

背景技术

人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。就基因序列分析而言，后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。在基础研究方面，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，通过对某一特定疾病的基因组样本中突变基因型进行大规模鉴定和检测，可以获得与该疾病相关基因型的信息。很多常见疾病的遗传学影响可归因于有限的等位基因变异。越来越多的证据表明，DNA甲基化参与了胚胎发育、基因印迹等过程。同时，它在疾病发展中也起着举足轻重的作用。甲基化状态的改变被认为是引起癌症的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化水平的降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。

DNA甲基化分析包括定性与定量分析，目前有很多方法可以选择。基因组DNA经过亚硫酸氢盐处理后，原始序列中未被甲基化的胞嘧啶(C)残基转化为尿嘧啶(U)，并在PCR扩增中以胸腺嘧啶(T)出现；而被甲基化的胞嘧啶则保持不变。从亚硫酸氢盐转化这条主干道出发，之后可以选择限制性酶切分析、实时定量PCR、Sanger测序、焦磷酸测序、以及高通量DNA测序等。然而，并非所有方法都能提供单个CpG位点的定量数据。样本经亚硫酸氢盐处理后PCR产物的Sanger测序一度被认为是甲基化分析中的金标准，但如果对5-10个克隆测序，这种方法充其量只是半定量。高通量DNA测序对于甲基化研究，带来了非常灵敏的DNA甲基化图谱，以单分子分辨率覆盖整个CpG岛。高通量DNA技术实现了整个CpG岛的更全面覆盖，且单分子分辨率为甲基化模式的异质性提供了前所未有的信息。它能够平行研究多个位点。然而，这些优点也伴随着一些劣势，比如相当大的一笔投资、试剂昂贵、周转时间长、数据分析要求高等。这些特点使得高通量DNA测序技术更适用于在基因组范围内目标区域的确定，而对不同样品在目标区域的CpG位点的定量分析由于样品数量大，如果每个样品都采用高通量DNA测序技术进行分析，则成本就会过于巨大。

传统的焦磷酸测序技术能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测。样本经过亚硫酸氢盐处理后的PCR产物在焦测序延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。德国汉诺威医学院Potapova领导的研究小组对高通量DNA测序和焦测序进行了系统的交叉验证(BMCBiotechnology,2011,11:6)，对10个原发性肝癌标本中12个位点的甲基化模式在高通量DNA测序所获得的单个CpG位点的甲基化水平与传统焦测序相应值进行比较的统计分析表明，所有单个CpG位点的甲基化水平都有着极佳的一致性。表明传统的焦测序技术是一种可用于目标区域的CpG位点定量分析的简单、价格便宜的分析技术。