[发明专利]一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒及其应用。采用的技术方案是：动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒原代培养肝脏细胞、DMEM完全培养基、底物缓冲液、NAD+溶液和2,4‑二硝基苯肼溶液构成，该试剂盒可用于分析药物对肝脏细胞的损伤。本发明能提供一种有效分离原代肝脏细胞的方法及用作药物分析的试剂盒，原代分离培养肝脏细胞易贴壁，复苏后培养肝脏细胞状态佳，试剂盒测量效果良好，可作为判断药物对肝细胞损伤的依据之一。本发明可广泛应用于肝脏生理功能探索，细胞病理学、药理和毒理学机制的研究，以及新型药物肝细胞毒性检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒及应用试剂盒检测药物肝细胞毒性的方法。

背景技术

肝脏是机体以代谢功能为主的重要器官之一，有着去毒素、储存糖原、参与分泌性蛋白质的合成及生物转化等作用，也是最主要的药物代谢器官。病毒性肝炎在我国有着较高的发病率，常在携带多年后演变成肝硬化，甚至发展成肝癌，危害患者生命。

目前，国内外开发的治疗肝脏疾病的药物种类很多，主要分为抗病毒药、免疫调节剂及改善肝功能药等。肝脏细胞是患病主要的靶细胞，因此，在药物的筛选过程中，以肝脏细胞作为靶细胞，可以快速的筛选出具有治疗肝脏疾病的药物。所以，体外分离培养肝脏细胞，制备药物分析试剂盒是目前研究肝脏疾病的重要途径。而在这一过程中，体外分离培养肝脏细胞是关键。

目前，已有一些分离培养肝脏细胞的方法，但细胞纯度及活性相对较低。常用的方法主要有：非酶消化法和酶消化法。

非酶消化法又可分为：(1)直接分离法：①机械法:将离体动物肝脏剪成小块后利用物理手段分离肝脏细胞的方法。②螯合法:利用螯合剂灌注去除Ca2+依赖性粘附因子，通过断裂细胞间桥粒分离肝脏细胞，单独使用效果欠佳，故常与酶消化法结合使用。(2)组织块培养法：将离体动物肝脏剪成小块后用缓冲液或生理盐水冲洗去除游离的血细胞，利用组织块贴壁法，使之均匀贴壁培养，分离肝细胞。

酶消化法可分为：(1)胰酶消化法：胰酶是有效的消化剂，但它不仅可以消化细胞间连接，也可消化细胞本身，所以易对肝细胞膜造成破坏。(2)胶原酶消化法：利用胶原酶来破坏细胞间的连接，能特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。通过胶原酶来破坏肝脏细胞间的连接，来分离的肝脏细胞活性良好。其中，肝脏细胞全程无菌操作是关键因素，还有消化液消化时间及灌流速度都是会决定肝脏细胞分离培养成功与否的重中之重，影响着后续研究进程。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高动物原代肝脏细胞纯度及活性的体外细胞培养方法，并利用动物原代肝脏细胞制备肝脏药物分析试剂盒，从而快速筛选治疗肝脏疾病药物的方法。

本发明采用的技术方案是：一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒，由原代培养肝脏细胞、DMEM完全培养基、底物缓冲液、氧化型辅酶Ⅰ溶液(NAD+)和2,4-二硝基苯肼溶液构成。

上述的一种动物原代肝脏细胞药物分析试剂盒，所述的原代培养肝脏细胞的制备方法是：

1)将动物肝脏组织块放入平皿，采用灌流法，控制蠕动泵流速为0.9-1.7mL/min，灌入D-Hanks缓冲液冲洗血细胞，然后以同样流速灌流消化液10-20min；

2)将冲洗后的肝脏组织转移到新的平皿中，用细胞刷轻轻将细胞刮下，加入磷酸盐缓冲液，重悬细胞，过200目筛网，300r/min离心4min，弃上清液；

3)加入4℃预冷的DMEM完全培养基重悬沉淀，300r/min离心4min，弃上清液，再次重悬沉淀，500r/min离心4min，弃上清，得原代培养肝脏细胞。