[发明专利]一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法及应用

权利要求书

1.一种具有增强免疫功能浒苔多糖的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

1)浒苔粗多糖提取：称取浒苔干品，加入20倍水，于90℃提取三次，每次2h，纱布过滤，取浸提液旋转蒸发浓缩到原体积1/6，再加入3倍体积95％乙醇，4℃过夜，得白色絮状沉淀，冷冻干燥，即为浒苔粗多糖；

2)浒苔粗多糖脱蛋白：将浒苔粗多糖溶于蒸馏水，于60℃水浴中加热溶解，冷却后调整溶液pH值到6.5，加入木瓜蛋白酶，浒苔粗多糖终浓度为3％，50℃恒温水浴2.5h后，将溶液于90℃，加热5min，灭活木瓜蛋白酶，冷却至室温后，加入1/4V的Sevage试剂、即氯仿：正丁醇为4：1的试剂，反复震荡萃取30min后，3000r/min离心15min，溶液分层，最上层是多糖溶液，中间凝胶层即为变性的蛋白质，最下层为有机溶剂，收集最上层溶液，反复多次萃取，直到没有凝胶层为止，减压浓缩除掉上清液中有机试剂；

3)高速离心法去除小分子杂质：先用浓氨水调整多糖液pH至8.0，再向其中加入10％的过氧化氢溶液同时快速搅拌，直至溶液变为淡黄色，50℃以下保温2h脱色素，降至室温，将多糖溶液于6000r/min离心15min，去除小分子杂质；

4)氧化法脱去色素：将多糖溶液装入阻滞分子量为3500Da的透析袋里，用蒸馏水透析，2h后更换一次透析液，4℃过夜；次日用8000Da的聚乙二醇浓缩糖液至1/3体积后，反复用蒸馏水清洗透析袋表面，收集浓缩的多糖溶液，低温干燥，得浒苔多糖的粗制品；

5)Sephacryl-300凝胶层析柱纯化多糖：将浒苔多糖的粗制品加热溶解于蒸馏水中，多糖浓度为50mg/mL，打开Sephacryl-300层析柱打开水口，待液面几乎与柱床平齐时，关闭出水口，轻缓加入5mL多糖溶液，防止冲击基质，再次打开开关，待样品刚好与柱床相平时，关闭阀门，用少量蒸馏水冲洗基质表面及层析柱管壁，打开阀门，待液面与柱床平齐时，关闭阀门，缓慢加入蒸馏水，充满整个层析柱后，安装层析装置，开始洗脱，其洗脱速度为1min/mL，每管洗脱3min，共收集40管后，将含有多糖的洗脱液收集一起，减压浓缩后，低温冻干，即为EP；

6)在第5)步之后对其进行乙醇分级纯化：将EP溶液加入无水乙醇，使其乙醇终浓度为40％，4℃过夜沉淀多糖，3000r/min离心15min后，分离上清液和沉淀，低温冻干沉淀即为EP1；再向上清液中加入无水乙醇，使其终浓度达到60％后，4℃过夜沉淀多糖，6000r/min离心15min，再次分离上清液和沉淀，低温冻干沉淀即为EP2；再向剩余的糖液中加入无水乙醇，待乙醇浓度达到80％时，4℃过夜收集沉淀，低温冻干即为EP3。

2.根据权利要求1所述的浒苔多糖EP2在制备增强淋巴细胞免疫药物中的应用。