[发明专利]一种CD24抗体融合蛋白的设计及其应用

说明书

本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及一种CD24抗体融合蛋白的制备方法及用途。本发明利用基因工程技术将CD24单链抗体rG7S与MICA分子胞外1‑3区通过G₄S柔性肽相连接，哺乳动物真核表达体系稳定表达rG7S‑MICA；CD24抗体融合蛋白rG7S‑MICA能同时结合于肿瘤细胞表面的CD24分子和NK细胞表面的活化型受体NKG2D，重塑NKG2D途径诱导的NK细胞对CD24⁺肿瘤细胞的免疫监视作用，最终达到激活机体自身免疫系统有效杀死CD24⁺肿瘤细胞的目的。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可同时与白细胞分化抗原CD24(cluster ofdifferentiation 24)和NKG2D受体特异性结合的CD24抗体融合蛋白rG7S-MICA，其利用rG7S的靶向性将MICA特异性地展示于肿瘤细胞表面，避免了由于细胞表面MICA分子表达下调与脱落引起的肿瘤免疫逃逸。在体内外试验中，CD24⁺肝癌细胞Huh-7表面的MICA通过MICA-NKG2D信号通路有效募集并激活NK细胞，诱导其释放穿孔素-颗粒酶，分泌IFN-γ、TNF-α等多种细胞因子，有效杀伤肿瘤细胞并抑制其生长。rG7S-MICA的设计开辟了一种新的肿瘤免疫治疗策略，是一种特异性重塑NK细胞对CD24⁺肿瘤细胞免疫监视功能的双功能抗体融合蛋白。

背景技术

当今全球恶性肿瘤发病率及死亡率一直呈上升趋势。肿瘤免疫逃逸是指肿瘤细胞表面标记物脱落导致其逃脱免疫监视，这也是放化疗法常产生耐药和低安全性评价的瓶颈所在。因此，寻找特异性的分子靶标与新颖的临床用药手段是肿瘤个性化治疗的关键。肿瘤免疫治疗旨在重塑机体自身免疫系统对肿瘤细胞的识别与杀伤能力，利用“生物导弹”将机体中天然存在的免疫细胞这种弹药特异性地募集至肿瘤病灶部位，该策略具有高特异性与低副作用的优势。

肿瘤相关性抗原MICA

MICA(MICA，major histocompatibility complex class I chain-related geneA)是一种高度糖基化的蛋白质分子，属于非经典HLA-I(human leucocyte antigen-I)类基因家族。MICA广泛且特异性地表达于上皮来源的原发性肿瘤细胞中，是一种公认的肿瘤相关性抗原。NK细胞或CD8⁺T细胞借表面受体NKG2D与配体MICA/B的相互作用而与肿瘤细胞靠近、结合，进而通过释放细胞因子等诱导肿瘤细胞的溶解。虽然证实MICA分子表达于多种肿瘤细胞表面，但MICA的脱落导致肿瘤细胞虽然仍属于MICA阳性，但却能避开免疫监视并导致免疫逃逸。因此寻找一种新的展示方式以重塑MICA在肿瘤免疫监视中的作用成为肿瘤免疫治疗策略的关键，抗体是激活和重建机体肿瘤免疫作用的一种常规靶向药物，其中单链抗体由于其分子量小更容易通过血脑屏障到达病灶部位而更多地用于此类靶向设计。由此我们提出一种假设：将MICA分子与抗体融合，借助于靶向肿瘤细胞表面抗原的抗体对肿瘤细胞的识别和结合，MICA被锚定于肿瘤细胞表面；进一步通过MICA与NKG2D的结合刺激NK细胞杀伤肿瘤细胞，重建由NKG2D途径激活机体自身的免疫监视作用。

NKG2D分子是C型凝集素样受体家族的一种同源二聚体II型跨膜蛋白。在肿瘤的生长进程中，MICA等配体下调或蛋白水解脱落会抑制NK细胞介导的免疫调控，而诱导NKG2D的配体在肿瘤细胞表面的表达会使肿瘤细胞更容易被NK细胞识别和杀伤。NKG2D通路活化效应细胞的分子机制：NKG2D与其配体结合，辅以接头蛋白分子DAP10或DAP12的帮助，激活下游信号通路，最终活化NK细胞。

肿瘤标志物CD24分子