[发明专利]一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌是引起人类严重小肠结肠炎的病原菌，该菌广泛存在于自然界如湖泊、土壤和植被及家禽、家畜和其他动物身体上。猪、牛、狗、猫、鸡等是储存宿主，人类主要通过污染的食物而感染，临床表现类型为胃肠炎型、阑尾炎和肠系膜淋巴结炎型、结节性红斑与关节炎型、败血症型。已知小肠结肠炎耶尔森氏菌有54个血清型，与人类关系密切的是Ｏ:3、Ｏ:9、Ｏ:8血清型。在中国，对人致病的主要是Ｏ:3、Ｏ:9血清型菌株，Ｏ:8血清型是美国、加拿大等国家的主要致病菌株，由于进口冷冻食品贸易的增加，Ｏ:8也是一个值得重视的血清型。由于本菌在低温中能生长，所以保存在4℃冰箱中的食品更具传染性，因此被称之为“冰箱病”。

目前，常用分离培养、生化鉴定的方法和聚合酶链式反应法（PCR法）确认病原菌。分离培养、生化鉴定法整个过程约需8~10天，不利于小肠结肠炎耶尔森氏菌的快速诊断和传染源的尽早隔离。PCR方法需要专业技术人员使用专业仪器设备在实验室完成，基层单位无法进行检测，因此市场迫切需要一种快速、简便、特异、灵敏的检测试剂制成的试纸条。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条制备方法，可有效解决现有检测方法费时、繁琐、特异性差的问题。

本发明解决的技术方案是，一种致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌测试条，包括基材PVC板和玻璃纤维膜，基材PVC板1上依次固定有引水玻璃纤维3、载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2和吸水棉浆板5，所述的硝酸纤维膜2上包被有检测区8和质检区9，所述的引水玻璃纤维3和载体玻璃纤维4上覆盖有第一覆膜7，所述的吸水棉浆板5上覆盖有第二覆膜6，由以下方法实现：

（1）制备纯化的单克隆抗体：

取1份小鼠腹水和3份pH4.4的醋酸盐缓冲液，按每毫升腹水加100μl滴加正辛酸，混匀，18-25℃室温放置25-35分钟，4℃下15000转/分钟离心15-25分钟，弃去沉淀，上清液用NaOH调节pH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每毫升上清液中加入0.277g，18-25℃室温搅拌25-35分钟，15000转/分、4℃离心15-25分钟，弃上清液，沉淀物用所取小鼠腹水1/2倍体积pH7.2的PBS溶液溶解后，再放入作为透析液的pH7.2的PBS缓冲液中，4℃透析45-50小时，每9-10小时换一次透析液，制成纯化的单克隆抗体；

所述的小鼠腹水是指将液体石蜡注射于Balb/c小鼠腹腔内，注射量为300-500μl/只小鼠，10天后，分别将分泌抗Ｏ:3血清型、抗Ｏ:9血清型、抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×10⁶/只小鼠，小鼠腹部隆起后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即为抗Ｏ:3血清型、抗Ｏ:9血清型、抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体的小鼠腹水；

（2）制备活化乳胶颗粒：

用碳化二亚胺分别活化携带有羧基基团的红色、蓝色、黄色的乳胶颗粒，方法是①将碳化二亚胺加入到pH6.0的NaH₂PO₄溶液中，配制成体积浓度为20mg/ml的碳化二亚胺溶液；②用pH6.0的NaH₂PO₄溶液将乳胶液稀释至乳胶质量浓度为2%的乳胶悬液；③取240-260μl碳化二亚胺溶液加入到1200-1300μ1乳胶悬液混匀，即成悬液状的活化乳胶颗粒；

（3）制备标记物：

不同颜色的乳胶颗粒标记不同的单克隆抗体，红色乳胶颗粒标记抗Ｏ:3血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体、蓝色乳胶颗粒标记抗Ｏ:9血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体和黄色乳胶颗粒标记抗Ｏ:8血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌单克隆抗体；制备方法是：①将待标记抗体于pH6.0的NaH₂PO₄透析0.5-1.5h；②再按每毫升活化的乳胶颗粒加入20~200μg单克隆抗体，滴加入悬液状的活化乳胶颗粒中，4℃过夜；③用pH6.0的NaH₂PO₄漂洗1-3次，沉淀重新悬浮于含有体积浓度为1%牛血清白蛋白的缓冲液中，得标记物；④用玻璃纤维吸附标记物并干燥；

（4）包被纤维膜：