[发明专利]一种重组基因工程菌构建及高活性β-D-1;4-内切木聚糖酶的制备与应用

权利要求书

1.一种基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm ，其特征在于，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm 菌种保藏编号为CGMCCNo.10696。

2.如权利要求1 所述基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm的β-D-1,4-内切木聚糖酶氨基酸序列，其特征在于，所述序列如SEQ ID No.4 所示。

4.如权利要求1 所述一种基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm在制备β-D-1,4-内切木聚糖酶中的应用。

5.一种如权利要求2所述的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因序列优化方法，其特征在于，所述的具体优化方法步骤如下：

（1）在GenBank中检索出厌氧真菌Orpinomyces sp. PC-2 β-D-1,4-内切木聚糖酶基因序列，登录号：U57819；

（2）删除步骤（1）的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的N端编码MRTIKFLFALAITTVAKA的密码子；

（3）根据酵母密码子偏爱性对β-D-1,4-内切木聚糖酶基因的密码子进行初步替换；

（4）采用Oligo 6.0分析步骤（3）替换后基因序列中的限制性内切酶切割位点，通过密码子调整，消除基因序列中的Bgl II、Sac I、Sal I、SnaB I和Avr II的切割位点；

（5）采用BioEdit 7.0 分析步骤（4）调整后基因序列中mRNA 隐蔽剪接位点，并再次对密码子进行调整，以消除其中的隐蔽剪接位点GGTAAG、GGTGAT、AATAAA、ATTTA、AAAAAA和TTTTTT以及mRNA不稳定基序，并计算GC百分比，根据GC百分比对密码子进一步调整，使其处于40%-50%之间；

（6）采用RNA Structure 3.2 对步骤（5）的mRNA 二级结构的自由能进行分析，筛选获得自由能最低的基因序列，命名为xynAm；

（7）通过对步骤（6）筛选获得的xynAm基因序列采用全基因合成方法获得SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。

6.根据权利要求2所述优化的β-D-1,4-内切木聚糖酶基因xynAm的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9K-xynAm，所述重组载体pPIC9K-xynAm的具体构建方法为：将权利要求5提供的xynAm基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K均用SnaB I和Avr II双酶切，回收纯化酶切产物，纯化的目的基因和表达载体采用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α，经PCR以及BamH I 和 Sal I双酶切鉴定获得重组表达载体pPIC9K-xynAm。

7.一种如权利要求1所述基因工程菌巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115/pPIC9K-xynAm制备的高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶。

8.如权利要求7所述高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶在用于非治疗目降解木聚糖中的应用。