[发明专利]Cas9介导的家蚕基因编辑载体和应用

说明书

本发明公开了Cas9介导的家蚕基因编辑载体，包括组成型基因编辑载体和诱导型基因编辑载体，其中组成型基因编辑载体包括U6启动子调控sgRNA表达的表达框U6‑sgRNA和IE‑1启动子调控Cas9表达的表达框，诱导型基因编辑载体Cas9由Hr3‑39k诱导型启动子调控表达，本发明的Cas9介导的基因编辑载体能够稳定、高效编辑目的基因，为制备昆虫抗病毒转基因素材和具有高效抗病毒的品种提供了有力的工具。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及Cas9介导的家蚕基因编辑载体，还涉及该基因编辑载体的应用。

背景技术

CRISPR/Cas9基因编辑技术是细菌和古细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的一种有效抵御外源DNA入侵的免疫机制之一。是由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸内切酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组或非同源末端连接，进而实现在目的DNA上进行编辑。因为这一新系统相比以前的基因编缉系统具有制备简单、成本低、作用高效等优点，开发后获得了快速发展等优点。因此，基于CRISPR/Cas9基因编辑技术在持续感染的病毒或潜伏感染病毒疾病治疗中具有重大的潜在意义。

CRISPR/Cas9系统工作的基本原理是当病毒或噬菌体感染宿主细胞时CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA(CRISPR-derived RNA)，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上。并引导Cas9核酸内切酶在靶位点剪切双链DNA，随后，细胞的非同源末端连接修复机制(NHEJ)重新连接断裂处的基因组DNA，并引入插入或缺失突变，引起靶标基因错误的转录翻译，从而使基因丧失功能。这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA(single-guided RNA)进行简化。因此，这一简化的CRISPR/Cas9基因编缉系统能够准确、快速、直接清除入侵的外源DNA。

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫。BmNPV是蚕业生产上最常见的且危害最严重的一类病原，对蚕业生产影响巨大。利用当今发展迅速的基因工程技术，从根本上提高家蚕病毒抗性，是蚕业领域重要的研究课题。基因的敲除研究表明，缺失某些增殖必需基因，BmNPV将不能增殖。因此，抑制这些病毒增殖必需基因的表达将成为防治家蚕感染BmNPV的一种有效策略。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以BmNPV增殖必需基因为靶基因而构建基因编缉载体，再将其导入家蚕细胞并持续表达能够导致BmNPV增殖必须基因发生插入或缺失从而丧失功能，是防治家蚕感染BmNPV和培育家蚕抗病毒品系的有效手段。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供Cas9介导的家蚕基因编辑载体；本发明的目的之二在于提供含有Cas9介导的家蚕基因编辑载体的转化子，本发明的目的之三在于提供Cas9介导的家蚕基因编辑载体的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

Cas9介导的家蚕基因编辑载体，包括U6启动子调控sgRNA表达的表达框U6-sgRNA和IE-1启动子调控Cas9表达的表达框。

优选的，还包括荧光标记系统。

更优选的，所述荧光标记系统为Mcherry红色荧蛋白。

优选的，所述Cas9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达框U6-sgRNA含有如SEQID NO.2所示的核苷酸序列，IE-1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

更优选的，所述Mcherry红色荧蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

优选的，所述Cas9由SEQ ID NO.18所示的Hr3-39k诱导型启动子调控表达。