[发明专利]一种人糖化血红蛋白的制备方法

说明书

本发明公开了一种人糖化血红蛋白的制备方法，包括以下步骤：从血液样品中提取红细胞，对所得红细胞进行洗涤，释放红细胞中的血红蛋白，对所得血红蛋白进行分离纯化，即可。现有技术很难获得高纯度糖化血红蛋白，并且存在回收率低和通量低的不足。本发明以成人健康志愿者和糖尿病患者的血液样本为原料，采用自由流等电聚焦模式高效制备。本发明方法可以得到纯度达96％以上的人糖化血红蛋白，并且人糖化血红蛋白的回收率可达到98％以上，比文献报道提高近30％。本发明具有很大的市场前景，制备的人糖化血红蛋白可以作为糖尿病检测标准品、制备多克隆抗体和单克隆抗体的抗原等。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种人糖化血红蛋白的制备方法，特别涉及到高效制备人糖化血红蛋白的方法。

背景技术

人糖化血红蛋白(HbA1c)是指人红细胞中血红蛋白的糖基化部分，是血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。它是由血液中葡萄糖附着在红细胞的血红蛋白上形成的，其与血中葡萄糖的含量高低呈正相关关系,血糖水平越高,附着葡萄糖的血红蛋白就越多，糖化血红蛋白水平也就越高。HbA1c可以间接反映血糖浓度的改变,同时也反映了机体糖代谢的状态。人体内的红细胞寿命为120天，在这120天内，血红蛋白不断与糖结合而生成HbA1c,并且这种结合在2周内成为不可逆反应，HbA1c趋于稳定,因此HbA1c可以反映病人在抽血前6-8周的平均血糖水平。HbA1c是糖尿病诊断新标准和治疗监测的“金标准”。

现有的提取人糖化血红蛋白的方法存在回收率、蛋白纯度以及制备通量较低等不足，比如采用非固定化胶条与聚丙烯酰胺等电聚焦的融合技术分离纯化HbA1c，回收率只有73.15％，纯度只能达到69.27％，离子交换层析分离提取HbA1c，纯度也只能达到79.78％。而自由流等电聚焦技术恰好弥补了这些不足，可以得到纯度达96％以上的人糖化血红蛋白，并且人糖化血红蛋白的回收率可达到98％以上，并可以实现连续分离纯化，显著提高了制备通量。

自由流电泳(Free flow electrophoresis，FFE)是一种兼具制备和分析功能的纯液相电泳技术，具有分离条件温和，回收率高，可连续分离的优点。Hanning于1961对FFE的工作原理进行了如下描述：背景缓冲液从装置入口端连续不断注入一个由两块平行板所构成的薄层分离腔内，在垂直于液流方向的电场的作用下，各组分根据其在电场中不同的电泳淌度而发生不同偏移，最后被分开的组分在出口端被连续不断的收集起来以备进一步分析(Hanning,K.,Fresenius J.Anal.Chem.1961,181(1),244-254.)。相较Hanning最初的定义，FFE经过几十年的发展，其形式更加多样，技术也更加成熟。FFE根据分离原理不同，可分为自由流区带电泳、自由流等电聚焦电泳、自由流等速电泳和自由流场梯度电泳。自由流等电聚焦电泳是目前FFE应用最广泛，分离效率最高的分离模式(Burggraf,D.,Weber,G.,Lottspeich,F.,Electrophoresis 1995,16,1010–1015.)。其基本原理就是在分离腔内分布着由一系列不同pH值构成的梯度缓冲体系，当带电物质移动到与其等电点相近的位置时由于其净电荷此时变为零而停止运动，各样品组分于是按照各自不同的等电点而在分离腔中不同的pH梯度处停下来并形成聚焦，整个聚焦分离过程结束后，分开的样品将随载体电解质缓冲液从不同的出口流出并被收集检测。

本发明使用连续式自由流等电聚焦电泳装置即通用型连续式自由流电泳装置高效制备人糖化血红蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种人糖化血红蛋白的制备方法，特别是一种操作简单，回收率高，纯度高的人糖化血红蛋白的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种人糖化血红蛋白的制备方法，包括以下步骤：从血液样品中提取红细胞，对所得红细胞进行洗涤，释放红细胞中的血红蛋白，对所得血红蛋白进行分离纯化，即可。

优选地，所述血液样品取自成人健康志愿者或糖尿病患者。