[发明专利]一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法

说明书

一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，涉及蛋白质化学领域技术领域；取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，低温离心，获得变性的蛋白溶液；将铜螯合磁珠与变性的蛋白溶液进行混合，孵育，得到磁珠蛋白混合溶液；在磁珠蛋白混合溶液中加入其体积1倍的缓冲液1混悬，在外加磁场下倒去一半的上清液；重复4‑5次，得到混合液A；在混合液A中加入其体积1倍的缓冲液2，将所有的特异性铜结合蛋白，即铜蛋白质组分离出来，外加磁场下收集铜蛋白质组；本发明利用磁珠‑IDA来分离变性条件下的金属蛋白质组，大大简化了程序，提高了金属蛋白的获得效率，建立了一套适合于过量重金属处理条件下组织或细胞中金属蛋白质组的分离方法。

技术领域

本发明涉及蛋白质化学领域技术领域，具体的说是一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法。

背景技术

全国污染状况调查公报显示，全国土壤污染总超标率为16.1%，其中重金属污染占80%以上。土壤中的重金属大多数容易在植物体内积累，并通过食物链危害人类的健康。另一方面，由于蛋白质的半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸残基对二价金属离子有很高的亲和力，因此细胞内的过量的重金属可能干扰必需金属元素与蛋白的结合，造成蛋白变性或酶失活，干扰正常的代谢过程。

蛋白质组学技术目前已经成为功能基因组领域一个重要的研究手段。一个蛋白质组（一个基因组或一个细胞、组织内所表达的所有蛋白质）中所有具有金属结合位点的蛋白称为金属蛋白质组（Metalloproteome）。从生物组织或细胞的全套蛋白质中找到的金属位点会保留生物学的关联性，这对于了解细胞内金属元素的动态平衡具有重要意义。

固定化金属亲和层析（IMAC）与质谱偶联是鉴定金属结合蛋白的重要技术。IMAC是利用蛋白中的一些氨基酸，如半胱氨酸、组氨酸和色氨酸等，能与固体柱上吸附的金属阳离子（如Zn2+, Cu2+, Ni2+和Co2+等）发生结合的特性，来分离具有该金属结合位点的蛋白质。但IMAC需要进行装柱、洗脱等多个过程，试验程序麻烦。

磁珠是今年来发展起来并已广泛应用于医学生物学领域的一种多功能试剂，它由磁性内核和核外包裹的高分子外壳两部分组成，利用磁核对外磁场的响应，可以将磁珠从周围介质中迅速分离出来。Li等（2007）以纳米粒子为基质，用氮川三乙酸（NTA）包覆纳米粒子作为亲和络合剂，来提纯带有组氨酸标签的蛋白质，发现纯化效果显著优于IMAC，并且这种方法可省去装柱的繁琐程序。但该方法的不足之处是，NTA毒性很大，且价格不便宜，使用范围受到限制。亚氨基二乙酸（IDA）是一种比NTA螯合能力更强、应用更为广泛的金属螯合剂，并且IDA价格便宜，不同基质偶联的 IDA-Ni在天然或变性条件下都能较好地纯化HIS标签重组蛋白。

由于自然状态下绝大多数蛋白的金属结合位点存在于分子内部，因此我们很难通过固定金属法来分离到完整的金属蛋白组，但是之前对金属结合蛋白的研究文献中均未对此加以考虑。

发明内容

本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，利用铜螯合磁珠来分离变性条件下的金属蛋白质组，大大简化了程序，提高了金属蛋白的获得效率，建立了一套适合于过量重金属处理条件下组织或细胞中金属蛋白质组的分离方法。

一种利用铜螯合磁珠分离铜蛋白质组的方法，包括以下步骤：

（1）、取生物组织或细胞用液氮充分研磨后，加入蛋白提取液，混合均匀后，低温离心，获得变性的蛋白溶液；研磨后生物组织或细胞与蛋白提取液的固液比为：1:4；所述蛋白提取液的组成成份为：每升蛋白溶液中含50 mmol/L磷酸钠, pH 7.8，300mmol/L 氯化钠,质量百分比为0.1-1% 的Triton X-100, 8mol/L尿素，余量为水；