[发明专利]一种黑葡萄穗霉菌单端孢霉烯族A类毒素菌株的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于真菌毒素菌株检测领域，具体涉及一种黑葡萄穗霉菌（StachybotrysChartarum）单端孢霉烯族A类毒素菌株的分子检测方法，本发明可用于谷物、饲料、食品安全和环境中黑葡萄穗霉菌（S.Chartarum）单端孢霉烯族A类毒素的检测。

背景技术

黑葡萄穗霉（S.Chartarum）属于半知菌亚门（Deuteromycotina），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目（Hyphomycetales），暗色孢科（Dematiaceae），葡萄状穗霉属（Stachybotrys）。黑葡萄穗霉广泛存在于环境中并对人类生活造成严重影响，黑葡萄穗霉菌（S.Chartarum）单端毒素具有极强的致癌性和广泛的污染性，并且难以去除，是单端毒素的监测与控制已成为影响食品工业安全的重要因素之一。

目前，国内外有关黑葡萄穗霉及其代谢产物的检测方法包括以下几个方面：

①免疫学方法：Van等采用黑葡萄穗霉中获得的穗霉菌溶血素制备抗体，应用酶联免疫吸附实验来分析人血清和环境样品中穗霉菌溶血素；②荧光探针及PCR的应用Haugland等应用TaqMan荧光探针系统实时检测PCR产物来定量测定空气样品中黑葡萄穗霉孢子，在定量检测不同污染房屋空气样品中黑葡萄穗霉孢子时，该法与直接计数结果一致，Roe等也采用TaqMan荧光探针实时检测PCR产物，用来分析室内粉尘样品中产毒真菌种类；③气相色谱P质谱联机：Gao等应用气相色谱P质谱研究黑葡萄穗霉产生的特殊生物挥发性有机化合物，发现对于一个特定菌株，在不同培养基上可产生明显不同的挥发性有机化合物，因此，可应用标记的特殊挥发性有机化合物作为指纹图谱来鉴别室内环境中真菌；④指示微生物：Zaichenko等在研究中发现单细胞的蓝绿菌对他们研究的所有葡萄状穗霉毒素高度敏感，认为蓝绿菌可作为检验这类毒素的指示微生物。

在毒素产生之前，从黑葡萄穗霉菌（S.Chartarum）毒素产毒菌源头进行监控，将是控制毒素污染的有效方式。免疫学方法、荧光探针及PCR方法、气相色谱P质谱联机法、高效液相色谱法等可以鉴定毒素种类、孢子浓度和真菌种类，但操作繁琐，过程复杂。指示微生物法虽然可以作为检测毒素菌株的方法，但是缺乏唯一性，其他传统方法因其繁琐费时费工、灵敏度差等缺点而无法满足现代工业实时快速检测诉求；因此，开展黑葡萄穗霉菌（S.Chartarum）产毒菌菌株快速分子检测方法的研究具有重要意义。

发明内容

本发明目的在提供一种黑葡萄穗霉菌（S.Chartarum）单端孢霉烯族A类毒素菌株的分子鉴定方法，能够解决传统培养法、发酵产生毒素、高效液相色谱法检测、核磁共振和质谱等方法和过程的繁琐、费时、费工等缺点。与传统的形态学和生理学鉴定方法相比，分子鉴定具有简单、快速、准确的优点，可为产毒真菌危害的早期预警提供可靠的技术支持，对有效防控真菌毒素污染具有重要的现实意义。

本发明所采用的技术方案是针对黑葡萄穗霉菌（S.Chartarum）单端孢霉A类毒素，通过Tri5基因信息设计一对特异性引物，从黑葡萄穗霉菌（S.Chartarum）分离得到单端孢霉烯族A类毒素菌株的特异性片段（其长度为460bp），而不产单端孢霉烯族A类毒素的黑葡萄穗霉菌（S.Chartarum）中不能扩增到该特异片段，采用PCR反应，利用琼脂糖凝胶电泳检测产物，直接根据产物片段的有无及大小，即可确定某一黑葡萄穗霉菌（S.Chartarum）是否产单端孢霉烯族A类毒素。具体步骤为：1）根据Tri5基因信息设计一对高度特异性引物，上游引物tri5S1：5’-CCTCACCCTCAGATGTTGACATAC-3’和下游引物tri5S2：5’-TCCTTGTAGAAGGACATGAGGTCG-3’；2）利用该引物对黑葡萄穗霉菌的总DNA进行PCR扩增；3）利用琼脂糖凝胶电泳检测产物，分离得到长度为460bp的条带的单端孢霉烯族A类毒素菌株的特异性片段；4)根据产物片段的有无，或者能得到的条带片段的长度是否为460bp，即可确定某一黑葡萄穗霉菌是否产单端孢霉烯族A类毒素。