[发明专利]一种羟基四氢嘧啶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及化合物生物技术生产领域，具体涉及一种羟基四氢嘧啶的制备方法。

背景技术

现有技术中，羟基四氢嘧啶主要通过盐单胞菌发酵来获得。朱道辰等人研究了利用嗜盐菌HalomonasventosaeDL7发酵生产羟基四氢嘧啶的方法。该发酵过程中需要先进行菌体培养，再在短时间内(1h内)将氯化钠浓度从1M提高到3M并将培养温度从30℃提高到42℃以积累羟基四氢嘧啶。最终提取得到的胞内外四氢嘧啶总浓度为13.8g/L，羟基四氢嘧啶总浓度为6.2g/L。

上述发酵法存在以下缺陷：(1)羟基四氢嘧啶作为四氢嘧啶的衍生物其合成受到热刺激的诱导，即需要提高生长温度才能够促进其合成，但是提高生长温度会严重抑制嗜盐菌的生长，导致四氢嘧啶合成量的严重下降，从而影响了羟基四氢嘧啶的产量；(2)嗜盐菌发酵培养基中盐浓度较高，且发酵液中会同时存在四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶，二者性质接近，故较难对羟基四氢嘧啶分离纯化。综上所述，现有发酵法具有生产成本较高，控制工艺复杂，产物回收困难，难于真正实现工业化生产的缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效、低成本制备羟基四氢嘧啶的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种羟基四氢嘧啶的制备方法，利用含有四氢嘧啶的料液为底物，加入具有四氢嘧啶羟化酶活性的大肠杆菌、α-酮戊二酸，在pH7.0-8.0、37-45℃条件下进行酶促反应合成羟基四氢嘧啶。

优选的，上述羟基四氢嘧啶的制备方法，具体步骤如下：

(1)在大肠杆菌BL-21(ACCC11171)(ACCC，中国农业微生物菌种保藏中心)中异源表达四氢嘧啶羟化酶编码基因，构建具有四氢嘧啶羟化酶活性菌株E.coliHect；

(2)将上述E.coliHect菌株在培养基中培养，产生高酶活性的四氢嘧啶羟化酶；

(3)将步骤(2)中培养获得的具有四氢嘧啶羟化酶活性的细胞(E.coliHect细胞)与含有四氢嘧啶的发酵液或四氢嘧啶水溶液混合，再加入等摩尔量的α-酮戊二酸，在pH7.0-8.0、37-45℃条件下进行酶促反应合成羟基四氢嘧啶。

优选的，上述羟基四氢嘧啶的制备方法，所述步骤(1)以pET-his质粒为载体在大肠杆菌BL-21中过表达四氢嘧啶羟化酶编码基因得到具有四氢嘧啶羟化酶活性菌株，所述四氢嘧啶羟化酶编码基因来源于斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri，CGMCC1.8597)、伸长盐单胞菌(Halomonaselongate，CGMCC1.6329)、嗜盐甲烷氧化菌(Methylomicrobiumalcaliphilum20Z，DSM19304)或其他含有四氢嘧啶羟化酶编码基因的菌株，其中，

所述编码斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)ectD基因的核苷酸序列为序列表<400>1所示序列；

所述编码伸长盐单胞菌(Halomonaselongate)ectD基因的核苷酸序列为序列表<400>2所示序列；

所述编码嗜盐甲烷氧化菌(Methylomicrobiumalcaliphilum20Z)ectD基因的核苷酸序列为序列表<400>3所示序列。

优选的，上述羟基四氢嘧啶的制备方法，所述步骤(2)中菌株在培养基中培养的具体步骤如下：

①菌株按照1％接种量接种到150ml培养基中，37℃，200rpm培养；

②待OD长到0.6-0.8时添加终浓度为0.1-0.3mmol/L的IPTG诱导表达蛋白；调整温度为32℃，200rpm继续培养培养；

③继续培养6-8h后，4℃，6000rpm冷冻离心收集菌体；

④搜集的菌体使用PBS缓冲液重悬并洗涤三次，使用移液器吸净残留液体，最后离心保存于-80℃冰箱备用。

优选的，上述羟基四氢嘧啶的制备方法，所述步骤(2)中培养基为：每10gNaCl，5g酵母粉，10g蛋白胨，用去离子水定容到1L。

上述羟基四氢嘧啶的制备方法，所得反应液中羟基四氢嘧啶的检测方法为：发酵液经13000rpm高速离心2min后取上清，并用去离子水稀释到一定浓度后使用高效液相色谱法测定四氢嘧啶含量；检测条件为：TSK-GELC18色谱柱，流动相为2％乙腈溶液，柱温30℃，流速1ml/min，进样量20μl，紫外检测波长230nm，保留时间5min。