[发明专利]一种组织工程软骨复合支架及其制备方法

权利要求书

1.一种组织工程软骨复合支架的制备方法，具体如下：

1)将新鲜关节软骨置进行低温湿法粉碎并过筛，得到直径100μm-500μm的软骨细胞外基质源性微粒后，进行脱细胞处理，去除免疫原性，制备得到软骨细胞外基质源性微载体；

2)将软骨细胞外基质源性微载体和种子细胞置于生物反应器中共培养，形成软骨微组织；

3)将三维多孔支架置于培养皿中，并浸没于水凝胶前体液中；

4)将步骤2)得到的软骨微组织填充于上述三维多孔支架的孔隙中，并向培养皿中添加水凝胶致凝剂，使软骨微组织与三维多孔支架结合成一个复合支架；

5)将培养皿置于37℃培养箱中孵育10-30分钟后，清洗，最终获得所述组织工程软骨复合支架。

2.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的低温湿法粉碎，是指将获取的新鲜关节软骨用无菌生理盐水反复冲洗干净后，与无菌三蒸水混合，并加入碎冰块，4℃条件下，置于粉碎机内进行粉碎。

3.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的脱细胞方法采用的是化学脱细胞方法，具体如下：将软骨细胞外基质源性微粒加入1％SDS溶液中,置于摇床内，4℃条件下振荡8小时，用无菌三蒸水反复冲洗后，再将软骨细胞外基质源性微粒加入DNA酶和RNA酶的混合溶液中，37℃条件下，置于摇床中振荡4小时。

4.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，步骤1)还包括：将封装好的软骨细胞外基质源性微载体置于25kGy Co⁶⁰射线下进行辐射灭菌后，存放于4℃条件下，备用。

5.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的共培养是指将种子细胞和软骨细胞外基质源性微载体以1-8×10⁶种子细胞/100mg软骨细胞外基质源性微载体的混合比例置于生物反应器中培养。

6.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的生物反应器的转速设置为20-50rpm，每转1分钟，间歇30分钟，24小时后，转速设置为50-100rpm，持续转动，生物反应器置于37℃5％CO₂条件下，培养基每2-3天更换一次。

7.如权利要求1所述的组织工程软骨复合支架的制备方法，其特征在于，所述的三维多孔支架为3D打印多孔PLGA支架或多孔脱钙骨基质支架；所述的水凝胶前体液为海藻酸钠溶液或纤维蛋白原溶液；所述的水凝胶致凝剂为CaCl₂溶液或凝血酶溶液。

8.一种组织工程软骨复合支架，是通过权利要求1-7任一项所述的组织工程软骨复合支架的制备方法将负载有种子细胞的软骨细胞外基质源性微载体填充于三维多孔支架孔隙内复合构建而成的。

9.如权利要求8所述的组织工程软骨复合支架，其特征在于，所述的种子细胞为软骨细胞或干细胞。

10.如权利要求8所述的组织工程软骨复合支架，其特征在于，所述的软骨细胞外基质源性微载体的直径为100-500μm，所述的三维多孔支架孔隙的直径为600-2000μm。