[发明专利]一株产角蛋白酶的副短短芽孢杆菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产角蛋白酶的副短短芽孢杆菌及其粗酶性质。

背景技术

角蛋白酶（Keratinases）是一种能专一降解天然角蛋白的蛋白水解酶。角蛋白存在大量的二硫键、氢键和疏水作用，不容易被普通蛋白酶水解，因而大部分未被利用，有的甚至造成环境污染。

角蛋白酶可用于制革工业。目前制革工业中脱毛基本采用灰碱法，但是脱毛废液中含有高浓度的硫化物，严重污染环境，而用酶法代替灰碱法脱毛便可彻底消除硫化物的污染，酶法具有清洁性、环境友好等特征，同时相比化学制革工艺更能提高产品的质量，因此在制革中应用已越来越广泛

角蛋白酶可用于医药行业。我国每年产生大量的家禽羽毛和废次羊毛，其主要成分是角蛋白。角蛋白酶可将家禽羽毛、废次羊毛降解转变为可溶蛋白质、多肽或者氨基酸，用作医药原料、动物饲料等，变废为宝，减少环境污染。

目前已发现30多种微生物能分泌角蛋白酶，国内外角蛋白酶的研究主要集中在真菌中的皮肤癣菌和白假丝酵母（Candidaalbicans），放线菌中的链霉菌（Streptomyces）和高温单胞菌属（Thermonspora）及细菌中的地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）等。

本发明的目的在于提供一株产角蛋白酶的副短短芽孢杆菌，并初步研究了其使用方法。

发明内容

（1）平板初筛：从江苏无锡农村羊圈采集土壤样品，取1g土样添加到10mL生理盐水中，制备土壤悬液，稀释涂布至初筛培养基平皿中，30℃培养3d。在分离平板上挑取能生长的较大的单菌落，划线分离至纯单菌落。

（2）摇瓶复筛：初筛得到的菌株经摇瓶发酵，测定其上清液角蛋白酶活力，发现7号菌酶活力较高。

（3）菌株16SrDNA鉴定：提取总DNA，用细菌16SrDNA通用引物扩增，得到的基因序列，经测序比对，为副短短芽孢杆菌(Brevibacillusparabrevis)，命名为R-7，于2015年5月11日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.10798。

（4）菌株发酵条件初步优化：利用单因素及正交实验对菌株的发酵培养基及发酵条件进行优化，得到最适培养基配方为羊毛1%，可溶性淀粉1%，玉米粉1%，NaCl0.15%，NH₄Cl0.05%，K₂HPO₄0.03%，KH₂PO₄0.04%，MgCl₂·6H₂O0.01%。摇床培养条件为：初始pH值为8.0，接种量2%，培养温度40℃，转速220r/min，装液量30mL/250mL，发酵周期16h，产角蛋白酶活力达到412U/mL。

（5）酶学性质研究：分别研究了作用温度和作用pH对该酶活力的影响，发现该角蛋白酶的最适作用温度为40℃，最适pH为7.0。

其中步骤（1）中所述的初筛培养基为：羊毛粉0.5%，K₂HPO₄0.1%，NaCl0.05%，琼脂粉2%；步骤（2）中所述的复筛摇瓶发酵培养基为：MgCl₂·6H₂O0.01%，K₂HPO₄0.03%，KH₂PO₄0.04%，NaCl0.05%，NH₄Cl0.05%，羊毛1%。

附图说明

图1为温度对酶活力的影响

图2为pH对酶活力的影响

具体实施方式

实施例1角蛋白酶产生菌株的筛选与鉴定

(1)培养基配方

①初筛培养基：羊毛粉0.5%，K₂HPO₄0.1%，NaCl0.05%，琼脂粉2%。

②种子液体培养基