[发明专利]基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法

权利要求书

1.一种基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的联合分析法包括步骤：

(1)样品DNA采集；

(2)定时定量PCR获取鱼类的总DNA丰度，具体包括步骤：

(2.1)通用引物的设计

所述的通用引物选择在16s rRNA基因区域进行通用引物和探针设计，所设置的16srRNA基因正向引物序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；16s rRNA基因反向引物序列为SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；16s rRNA基因探针序列为SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

(2.2)在设计好的通用引物下构建DNA标准品；

(2.3)制作标准曲线，具体步骤包括：

扩增包含检测目的的鱼类线粒体16s rDNA基因部分序列，进行PCR反应，反应产物经电泳检测后，采用TIANgel Midi Purification Kit，对PCR产物进行回收纯化；

将所述的PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化入感受态细胞中，挑选菌斑进行培养，提取质粒后进行限制性内切酶处理，琼脂糖凝胶电泳；

DNA胶回收后进行浓度测定，在A₂₆₀/A₂₈₀大于1.8的情形下，按下述公式计算质粒拷贝数：拷贝数＝6.02×10²³×质粒浓度(ng/μL)/(648×质粒总长度)(g/mol)；

质粒总长度＝2692bp+PCR产物长度；

其中，6.02×10²³是阿佛加德罗常数；648是每个碱基的平均分子量；

使用EASY Dilution将构建的DNA标准品分别按照1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL梯度稀释作为模板进行Real Time PCR反应，制作DNA标准曲线，每种浓度标准质粒设3个重复，并做无模板对照；

对构建的DNA标准品进行扩增反应，反应采用两步法：95℃30s预变性；95℃变性5s，55℃退火10s，72℃延伸21s，45个循环，反应结束后得到各自的Ct值，以Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数作为横坐标，制作标准曲线；

(2.4)实施定量PCR检测环境DNA的总鱼类DNA丰度

将待测试的各环境DNA样本在标准品条件下进行反应，反应后带入标准曲线以获得各环境样点的DNA相对丰度拷贝数；

(3)454GS-FLX Titanium测序分析鱼类物种组成比例；

(4)454测序数据和实时定量PCR数据联合分析目标物种

计算公式为：目标物种线粒体基因拷贝数＝实时定量PCR定量的鱼类总线粒体基因拷贝数×二代454测序获得的目标物种线粒体序列的百分比；

(5)环境中鱼类线粒体DNA相对分布的分布图绘制

使用sufer 8.0软件完成对环境中鱼类线粒体DNA相对分布图绘制。

2.根据权利要求1所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的各环境DNA样本为提前根据水域大小，设置样点并采集柱状水层混合后的水样冷藏，在实验室中抽滤，后提取DNA冷藏备用。

3.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的水样在24h内进行抽滤处理，滤膜孔径为1.2μm，抽滤后使用DNA提取试剂盒提取滤膜中的所有环境DNA，提取好的DNA在-20℃条件下保存备用。

4.根据权利要求1所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的各环境样点的DNA相对丰度拷贝数的测定过程具体如下：

反应条件和体系与制作标准品曲线时相同，各环境DNA样本不做稀释直接添加，每个样本设置2个平行，计算变异系数；反应后得到样品Ct值，把待测样品的Ct值代入标准曲线表达式可以算出它的初始拷贝数；由拷贝数可知所测物种在各样点的DNA相对丰度情况。

5.根据权利要求1所述的基于环境DNA技术对鱼类DNA丰度估算的联合分析法，其特征在于，所述的454GS-FLX Titanium测序分析鱼类物种组成比例具体为：

选取16s rRNA基因为引物，其中所设置的16s rRNA基因F引物序列为SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；16s rRNA基因R引物序列为SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

对环境样品DNA进行扩增，切胶回收后干冰保存；

测定样品浓度，将不同样品等摩尔混合，将3′端和5′端有特异性的接头连接到DNA片段上，变性后处理回收单链的DNA，接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，经过乳化扩增，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的平行扩增，产生数百万个形同的拷贝，最后将经过富集携带DNA片段的磁珠与其他反应物混合，放入到Pico TiterPlate板中开始测序；

使用Qiime1.5.0对初始序列质量进行控制和筛选；之后再使用PyNAST对序列进行去杂和修剪；序列优化后使用Uparse提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量，再按照97％相似性对非重复序列进行OTU聚类，在聚类过程中Uchime被用来检测序列中的嵌合体序列并去除，得到OTU的代表序列；用全部序列与OTU的代表序列进行Blast比对，得到每条序列与最相近的OTU的代表序列对应表，利用得到的OTU在NCBI数据库中对于测得序列所属的物种种类进行鉴定，并统计OTU的出现率从而得到鱼类的线粒体基因的组成比例信息。