[发明专利]一种检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组，更具体涉及一种基于环介导等温扩增检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组。

背景技术

甘薯卷叶病毒(Sweetpotatoleafcurlvirus,SPLCV)，属双生病毒科(Germiniviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)，主要寄主是甘薯、裂叶牵牛和圆叶牵牛，其引发的病害可导致甘薯发育异常、产量和质量严重受损及种性退化。20世纪80年代，该病害在中国台湾和日本的甘薯上发生。近几年，随着传播介体烟粉虱的种群及分布不断增加、人类的贸易及迁徙活动越发频繁，甘薯卷叶病毒的迅速扩散和广泛发生已经引起全球的关注。

目前，检测甘薯卷叶病毒的方法主要有PCR方法，弊端在于耗时长、依赖昂贵的检测设备。

近年来开发的环介导等温扩增(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和1个具有链置换特性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在等温条件下高效扩增靶基因。迄今尚未有应用该技术检测甘薯卷叶病毒的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测甘薯卷叶病毒的方法及其专用引物组。

本发明首先保护一种引物组，由序列表的序列1所示的单链DNA分子(SPLCV-F3)、序列表的序列2所示的单链DNA分子(SPLCV-B3)、序列表的序列3所示的单链DNA分子(SPLCV-FIP)、序列表的序列4所示的单链DNA分子(SPLCV-BIP)、序列表的序列5所示的单链DNA分子(SPLCV-LF)和序列表的序列6所示的单链DNA分子(SPLCV-LB)组成；所述引物组的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；(b)检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。

本发明还保护所述引物组在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；(b)检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。

本发明还保护含有所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒；(b)检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述引物组中的各条引物进行独立包装的步骤。

本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定甘薯卷叶病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测病毒的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组进行环介导等温扩增；如果所述引物组可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为甘薯卷叶病毒；如果所述引物组不能实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测病毒为或候选为非甘薯卷叶病毒。

本发明还保护一种检测待测生物样本中是否含有甘薯卷叶病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测生物样本的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，采用所述引物组进行环介导等温扩增；如果所述引物组可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，所述待测生物样本含有或疑似含有甘薯卷叶病毒；如果所述引物组不能实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，所述待测生物样本不含有或疑似不含有甘薯卷叶病毒。

所述待测生物样本为植物样本。所述植物具体可为番茄。

以上任一所述环介导等温扩增的初始反应体系中含有钙黄绿素和镁离子。

以上任一所述环介导等温扩增的初始反应体系中，SPLCV-F3和SPLCV-B3的浓度均为0.2μmol/L，SPLCV-FIP和SPLCV-BIP的浓度均为1.6μmol/L，SPLCV-LF和SPLCV-LB的浓度均为0.8μmol/L。

以上任一所述环介导等温扩增的初始反应体系(25μl)具体为：模板DNA，BstDNA聚合酶的浓度为0.32U/μL，SPLCV-F3和SPLCV-B3的浓度均为0.2μmol/L，SPLCV-FIP和SPLCV-BIP的浓度均为1.6μmol/L，SPLCV-LF和SPLCV-LB的浓度均为0.8μmol/L，钙黄绿素荧光染料的浓度为0.2μmol/L，甜菜碱的浓度为1mol/L，MgSO₄的浓度为6mmol/L，dNTP的浓度为1.6mmol/L。