[发明专利]一类荧光试剂，制备方法及其应用

权利要求书

1.一类荧光试剂，命名为BOPIM-NR，其特征在于，该试剂的结构通式为：

其中，R₁,R₂是为链烷基，进一步为-CH₃、-CH₂CH₃、-CH₂CH₂CH₃中的任一种。

2.权利要求1所述试剂的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)称取一定量的取代氨基苯甲醛，2-氰基吡啶，以及醋酸铵入微波反应器的三颈瓶中，温度设定为150～200℃，半小时后形成棕色溶液；

2)将该棕色溶液倒入冰水，加氢氧化钠中和，用碳酸钠检测，接着用乙酸乙酯做萃取剂，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得橙色固体；

3)在充氮气条件下，将上述橙色固体，三乙胺，加入二氯甲烷溶剂中，在冰盐浴滴加三氟化硼乙醚后再在室温条件下搅拌过夜，母液水洗，二氯乙烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶柱色谱分离，得到红棕色粉末状固体即为荧光试剂，标记为BOPIM-NR，具体合成路线为：

3.根据权利要求3所述的荧光试剂的合成方法，其特征在于，步骤1)中，对取代氨基苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸铵的摩尔比为1：2-3：4-7；步骤2)中，橙色固体与三氟化硼的摩尔比为1：4-6。

4.根据权利要求4所述的荧光试剂的合成方法，其特征在于，步骤1)中，对取代氨基苯甲醛、2-氰基吡啶、醋酸铵的摩尔比为1：2.5：5；步骤2)中，橙色固体与三氟化硼的摩尔比为1：5.5。

5.权利要求1-5任一项所述的荧光试剂在识别及定量血清蛋白(SerumAlbumin,SA)上的应用或在检测血清蛋白变性与否上的应用。

6.权利要求6所述的血清蛋白主要指牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)。

7.权利要求6所述的血清蛋白变性包括高温变性、化学变性、超声变性等一切物理及化学因素诱导的蛋白质结构的改变。

8.权利要求6所述的应用，其特征在于，具体检测方法如下：

(1)测定溶液的配制

称量BOPIM-NR，加入1,4-二氧六环助溶，再加入10mL磷酸盐缓冲液，得到2.0×10^-6mol/L的溶液，用保鲜膜和锡箔纸包裹好，密封，避光，置于冰箱中保存，同时，将正常或变性的血清蛋白，以磷酸盐缓冲液配制成1.0×10^-4mol/L溶液备用；

(2)荧光测定方法

取BOPIM-NR溶液加入石英荧光比色皿中，加入牛血清蛋白储备液10～100μL，在荧光分光光度计上设置365nm为激发波长，狭缝均调为10nm，在370～700nm范围进行扫描，得到BOPIM-NR在SA存在时的荧光光谱；

(3)定量测定牛血清蛋白含量

通过BOPIM-NR在不同浓度牛血清蛋白存在时的荧光光谱，固定发射波长485nm，读取荧光强度，应用以下方程：

1I-I0=1(I1-I0)+1(I1-I0)K[SA]]]>

式中：I₀、I和I₁分别为没有SA存在、有SA存在以及SA的浓度无限大时BOPIM的荧光强度，以1/(I-I₀)对1/[SA]作图，建立得到标准曲线，测定BOPIM-NR在未知样品中的荧光强度，通过标准曲线得到SA含量；

(4)SA变性鉴别方法

根据荧光试剂BOPIM-NR的荧光发射波长和峰型进行鉴别，在正常血清蛋白中，BOPIM-NR的荧光发射波长在较长波长方向，峰型对称；当血清蛋白变性后，化合物在其中的荧光发射波长蓝移约20nm，峰型不再对称，以此进行鉴别。

9.根据权利要求8所述的BOPIM-NR溶液配制采用1％(v％)1,4-二氧六环助溶。