[发明专利]一种酶法制备2,5-呋喃二甲酸的方法

权利要求书

1.一种酶法制备2,5-呋喃二甲酸的方法，其特征在于：将5-羟甲基糠醛溶解在溶剂中，以5-羟甲基糠醛氧化酶和脂肪酶为催化剂，一锅法中协同催化氧化，在氧气和/或空气下制备2,5-呋喃二甲酸；

所述溶剂为水、有机醇和酯组成，它们的体积比为：10:1-10:1-5；其中有机醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇中的一种或二种以上；酯为乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乳酸乙酯、乳酸甲酯、丁二酸单乙酯、丁二酸单甲酯、丁二酸二甲酯、丁二酸二乙酯中的一种或二种以上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 5-羟甲基糠醛于溶剂中的浓度为 0.001-10mol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的5-羟甲基糠醛氧化酶为重组表达蛋白，其基因序列见序列表SEQ ID NO：1中碱基序列；

反应体系中5-羟甲基糠醛氧化酶的加入量为：1-100umol/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的脂肪酶为Lipozyme RMIM，LipozymeTLIM，Novozym 435，lipase PS, lipase AS, lipase AK, lipase AYS中的一种或二种以上；

脂肪酶的加入量为： 0.1-100mg/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应的温度为20℃-40 ℃。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的5-羟甲基糠醛氧化酶制备过程如下：

将5-羟甲基糠醛氧化酶基因优化合成，用限制性内切酶XhoI和XbaI将HMF氧化酶基因接到pICZa-A表达载体上，转化至大肠杆菌 Top10，通过菌落PCR、酶切筛选鉴定阳性克隆子；重组质粒在大肠杆菌内扩增，用质粒纯化试剂盒回收质粒；

酵母电转化步骤如下：（1）把电转化杯从体积浓度75%的酒精中拿出，超净台风干，同时紫外照射20分钟，之后把转化杯放入冰盒预冷；（2）取80μL毕赤酵母感受态菌X-33，与5-10μg线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯，冰浴5分钟；（3）擦干水汽，置电转仪上，选择酵母参数电转化，电击参数为1500V，200V，25μF；（4）电击后立即加入1 mL冰浴的1mol/L山梨醇，转入15mL离心管中，30度静置1 h,然后加入2mLYPD培养基，YPD培养基的组成为重量体积比为 1% 酵母提取物, 2% 蛋白胨, 2% 葡萄糖, 30度摇菌3 h；（5）低速离心后涂YPD板，YPD板培养基的组成为重量体积比为1% 酵母提取物, 2% 蛋白胨, 2% 葡萄糖,100μg/mL 博来霉素；挑选毕赤酵母阳性克隆转化子，诱导表达前培养基为BMGY，BMGY培养基的组成为重量体积比为1%酵母提取物, 2%蛋白胨, 100 mM 磷酸钾缓冲液, pH6.0,1.34% 酵母氮源YNB, 4×10 ^-5 % 生物素 , 1%甘油；培养24小时后，离心去除BMGY培养基，改换BMMY培养基，BMMY培养基的组成为重量体积比为1%酵母提取液, 2% 蛋白胨, 100 mM磷酸钾缓冲液, pH6.0, 1.34% YNB, 4×10 ^-5 %生物素, 0.5-1% 甲醇，进入诱导表达阶段，每隔24 h向BMMY培养基中补加甲醇至终浓度V/V为 0.5-1％进行诱导表达，连续表达72-144 h；同时取发酵液离心, 收集上清即为5-羟甲基糠醛氧化酶液。