[发明专利]一种灵芝酸高产工程菌株kmust-VGB-1

说明书

本发明公开一种灵芝酸高产工程菌株kmust‑VGB‑1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.11301，本发明提供的灵芝工程菌，是通过选用灵芝强启动子P‑gpd表达透明颤菌血红蛋白VGB基因，得到高产灵芝酸灵芝工程菌kmust‑VGB‑1；通过摇瓶发酵实验表明，该菌在其细胞生长不受影响的情况下，VGB转化子菌株产单体灵芝酸GA‑Me，GA‑T，GA‑Mk，GA‑S分别是WT菌株的3.1，3.2，2.1，3.6倍，因此，本高产菌株可以作为生产灵芝酸的工程菌株，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和代谢工程领域的，具体涉及一种通过基因工程在灵芝中表达透明颤菌血红蛋白 vitreoscilla hemoglobin ( VGB )基因的方法，构建了一个灵芝酸的高产工程菌株。

背景技术

灵芝 ( Ganodermalucidum ) 是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌。灵芝真菌在我国有20多种，包括赤芝，黄芝，紫芝，黑芝，薄盖灵芝，树舌等。我国应用灵芝作为药物已有两千多年的历史。灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。由于其特殊的要用价值，灵芝的有效成分分析和药理学研究已经引起了国际上的广泛关注，尤其在日本，美国，韩国等国家。目前，灵芝的研究已经深入到了分子水平，一些专著相继出版，从不同的角度介绍了灵芝的生物学特性、栽培技术、药理学作用及临床应用等情况。

灵芝酸是一类分子结构中含有羧基的三萜类物质，从结构来看它属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物。自1982年Kubota T等人首次分离得到灵芝酸以来，目前已有130多种灵芝酸被分离出来。它们多为四环三萜类化合物，含有30个碳原子，结构中一般都有羟基，在IR中有较强的羟基吸收峰。在紫外光谱中也呈现多个波长的特征吸收，多数是在250 nm、237nm、365 nm处有吸收峰。灵芝酸具有许多重要的药理活性如：抗癌，灵芝酸类物质能明显抑制小鼠肝肉瘤 ( HTC ) 细胞的增殖；护肝，灵芝中的灵芝酸提取物能加强其解毒作用；抗HIV；降血压；抗氧化；抑制血小板凝集，抑制组胺释放，镇痛，抑制真核细胞DNA多聚酶活性，抑制法尼基蛋白转移酶活性和促进体液免疫功能等作用。

透明颤菌血红蛋白( vitreoscilla hemoglobin, VGB)是20世纪70年代后期发现的一种血红蛋白，该蛋白质能使透明颤菌在低氧的环境下生存，并保持较高的生长速率。透明颤菌为专性好氧的革兰氏阴性菌, 为贝日阿托氏菌属(Beggiatoa )，能在贫氧条件下合成一种可溶性的血红蛋白以满足其对氧的需求。自从VGB在大肠杆菌中成功地进行表达以来，VGB已在假单胞杆菌、链霉菌、霉菌和酵母等多种生物体内实现克隆，它已越来越多地应用到微生物发酵工业的许多领域, 并取得了显著成果。将表达透明颤菌血红蛋白(vitreoscillahemoglobin, VGB)的基因VGB，转化到灵芝基因组上，实现灵芝细胞内表达透明颤菌血红蛋白，促进灵芝细胞对氧气的利用能力。在限氧条件下，外源表达透明颤菌血红蛋白可以明显促进宿主细胞生长和蛋白的合成，同时VGB的表达可以促进氧的扩散，改善宿主的好氧代谢途径。