[发明专利]山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因功能领域，更具体地涉及山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物中，含有茎环结构的miRNA前体,经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子(18-25个核苷酸)。miRNA通过在转录水平或者转录后水平对基因组上的靶基因抑制其翻译或者切割靶基因来调控基因表达，在基因表达中起负调控其靶基因作用。miRNA在植物从成花诱导到花器官特征属性形成的整个花发育过程均发挥着关键作用。

山核桃(CaryacathayensisSarg.)属胡桃科山核桃属植物，雌雄同株，主要分布于浙江西部地区以及安徽地区，是我国特有的名优干果和木本油料树种，是山区农民脱贫致富的重要途径；然而，山核桃从种子播种到结果需要10余年的时间，从而较大程度抑制了山核桃的产量，如何缩短童期促进早实是山核桃研究者亟待解决的难题。

miR166是一种广泛存在于单子叶植物和双子叶植物中的miRNA。在植物众多miRNA中，研究表明miR166通过调节其靶基因：同源异型域一亮氨酸拉链蛋白(homeodomain-leucinezipperprotein，HD-Zip)，在植物对逆境胁迫的响应过程中发挥着重要作用。蒺藜苜蓿中过量表达miR166会造成植株根瘤和侧根数目减少，维管系统发育异常。受干旱诱导表达的miR166通过影响根的数量和维管组织，从而来调节植物的抗干旱能力。在缺水胁迫下蒺藜苜蓿根中miR166表达上调，且野生型蒺藜苜蓿在缺水胁迫下的表型与过表达miR166的转基因的植株表型相似。干旱胁迫下野生二粒小麦和大麦根中的miR166均表达下调，可能存在其他的未鉴定的靶基因。盐胁迫下玉米的miR166表达下调。山核桃miR166在植物开花或植物分生组织发育的作用未知。

发明内容

本发明提供了山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用。

山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用，所述山核桃miR166d的碱基序列如SEQIDNO.1所示。

优选地，所述植物是拟南芥或烟草。

优选地，所述植物是拟南芥。

获得山核桃miR166d转基因植株的具体方法包括：将包含所述山核桃miR166d的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获得转基因株系。

由于山核桃成熟miR166d本身序列很短，只有21bp，而其前体序列相对较长，连接到载体上，有利于转化实现，优选地，所述前体基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。

本发明公开了山核桃miR166d在提前植物花期或植物分生组织发育中的应用。应用山核桃miR166d，有望调控山核桃的花期和分生组织发育；更具体地，有望调控山核桃的花期和分生组织上的表型，例如降低山核桃的高度，增加分支数。

附图说明

图1为山核桃花芽的总RNA

图2为山核桃miR166d前体的中间载体菌液PCR检测

图3为山核桃miR166d前体的表达载体菌液PCR检测

图4为山核桃miR166d转基因拟南芥植株的抗性筛选

图5为山核桃miR166d转基因拟南芥的PCR检测

图6为野生型、拟南芥miR166d突变体和山核桃miR166d转基因拟南芥的叶片数目统计

图7为观察到的野生型、拟南芥miR166d突变体和山核桃miR166d转基因拟南芥的表型

具体实施方式

1.材料

1.1实验材料

山核桃花芽采自浙江省杭州市临安板桥村，选取不同株山核桃树进行采样。样品采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80℃冰箱保存待用。另外，购买拟南芥miR166d转基因的拟南芥突变体种子(购于美国ABRC)。

1.2实验试剂与仪器

DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。PCR仪为美国PE9700PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。

1.3引物合成及测序

引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.方法

2.1山核桃花芽总RNA的提取