[发明专利]一种乳腺癌特异性的热休克蛋白复合物及其应用

说明书

本发明公开了一种乳腺癌相关的Her‑2、EGFR及uPar蛋白表达的长度为9个氨基酸的肽段，所述肽段的氨基酸序列见序列表中的序列1至序列7中的任意一个。本发明还提供了这些抗原肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物及其制备方法，复合物包括gp96和HSP78与抗原多肽以非共价键结合的复合体，和二者以共价键连接形成的融合蛋白。这些肽段单独或形成的复合物可以诱导针对乳腺癌的特异性的CTL。这种复合物可用于制备乳腺癌的治疗和预防的疫苗。

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类能有效激活乳腺癌特异性T细胞的热休克蛋白复合物以及制备方法及其在治疗和预防乳腺癌中的应用。

技术背景

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，乳腺癌对妇女的生命健康的威胁尤为严重。现全世界每年乳腺癌发病已达到130 万例，乳腺癌与宫颈癌一起被称为女性“双癌”疾病。近年来随着分子生物学、细胞生物学、遗传学和免疫学等研究的不断进展，乳腺癌治疗已形成在传统的手术和放化疗基础上，结合内分泌治疗和生物治疗的综合治疗体系。

人源化抗体Trastuzumab(赫塞汀）靶向Her-2，通过介导细胞毒作用杀伤肿瘤细胞、阻断信号通路、抑制肿瘤细胞生长，取得了很好的治疗效果。目前赫塞汀己成为乳腺癌等治疗的一线药物。uPAR（Urokinase plasminogen activator receptor），表达于细胞表面，能够引起胞外基质的降解，从而在肿瘤的转移中发挥重要作用。68%的侵染性乳腺癌组织表达uPAR，并且抑制uPAR的表达可以增强HER-2抗体的抑增殖效果。EGFR(表皮生长因子受体)在多种恶性肿瘤组织中表达显著增高，在临床上应用EGFR的抗体可以显著减少癌细胞表面EGFR的水平发挥治疗效果。在乳腺癌患者中有接近一半的癌患者肿瘤组织过表达EGFR。现在已经出现针对这些乳腺癌相关抗原的靶向治疗方案。但是T细胞活化是肿瘤治疗最关键的因素，目前却没有很好的针对这些靶点的乳腺癌T细胞治疗方案。

gp96是热休克蛋白HSP90家族中的重要成员，主要定位于内质网腔(EndoplasmicReticulum)，在正常组织和肿瘤中均有广泛表达。正常情况下gp96在细胞中呈低水平表达，而热休克、葡萄糖缺乏、细菌和病毒感染等均可增加其表达。gp96分子具有多肽结合的能力，能结合5-25个氨基酸的多肽序列。热休克蛋白HSP78是细胞质中HSP70家族中的成员，分子量约78kDa。HSP78分子作为分子伴侣能与细胞中各种短肽结合。目前已证实gp96和HSP78分子可以结合多种组织特异性抗原多肽,包括泡状口炎病毒抗原区肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒抗原肽等。

在细胞外，gp96可作为呈递分子将结合的短肽呈递给I类MHC分子，激活特异性和记忆性T细胞，引发机体细胞免疫反应。因此HSP本身不具备抗原性，所结合的短肽决定了HSP复合物的抗原性。gp96还可以活化树突细胞（DC)促进MHC I类和MHC II类分子以及共刺激因子的表达，从而增强免疫反应。

肿瘤自体gp96复合物因为携带有患者自身肿瘤的抗原肽，可以激活患者个体特异性的T细胞反应杀伤肿瘤细胞，目前已成功应用于黑色素瘤、神经胶质瘤等的临床治疗。而乳腺癌相关的临床应用未见报道。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是筛选能激活乳腺癌特异性T细胞的肽段。克服肿瘤细胞免疫编辑导致的低免疫原性，能够在健康个体及乳腺癌患者中诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(杀伤性T细胞，CTL)，而且CTL具有强大的抗乳腺癌作用，对正常细胞及组织无破坏作用。