[发明专利]一种宫颈癌相关的热休克蛋白复合物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类能有效激活乳头瘤病毒（HPV）特异性T细胞的热休克蛋白复合物及其制备方法，以及其在治疗和预防宫颈癌中的应用。

技术背景

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，而宫颈癌是严重威胁妇女的生命健康的恶性肿瘤之一，其与乳腺癌一起被称为女性“双癌”疾病。据统计，全球范围内，每年大约有53万左右的宫颈癌新发病例，约27.5万死亡病例，其中85%的病例发生在发展中国家。在我国，每年新发病例约有10万，约占女性肿瘤的5%，且近年来呈现地区增长及发病年龄提前的现象。由于其对女性健康的重大危害及其所造成的社会问题，针对宫颈癌的相关研究一直是人们关注的焦点。近年来随着分子生物学、细胞生物学和免疫学等研究的不断进展，宫颈癌治疗在传统的手术和放化疗基础上，结合生物治疗的综合治疗体系已成为研究的热点。

手术治疗是早期宫颈癌重要的首选治疗手段，也是某些晚期宫颈癌不可缺少的综合治疗手段。放射治疗历来是宫颈癌的主要治疗手段，术前放疗可缩小肿瘤体积，降低癌细胞活性及术中播散，提高手术完整切除率。术后放疗的目的则是补充手术的不足，提高局部控制率，减少复发转移。晚期宫颈癌不能手术，则首选放疗。并且随着化疗技术的发展，近年来化疗也成为宫颈癌综合治疗的一部分。新辅助化疗(术前化疗)已被证实可明显提高患者的5年生存率，并越来越受到学者的重视。术前腔内放疗，然后再行根治性手术，其治疗效果更好。

近年来的研究证实高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要致病因素，通过激活针对HPV的B细胞产生抗体被认为可以很好的预防宫颈癌的发生。然而目前没有针对HPV激活特异性T细胞治疗和预防宫颈癌的报道。

gp96是热休克蛋白HSP90家族中的重要成员，主要定位于内质网腔(EndoplasmicReticulum)，在正常组织和肿瘤中均有广泛表达。正常情况下gp96在细胞中呈低水平表达，而热休克、葡萄糖缺乏、细菌和病毒感染等均可使其表达量上调。gp96分子具有结合多肽的能力，能结合含有5-25个氨基酸的肽段。热休克蛋白HSP78是细胞质中HSP70家族中的成员，分子量约78kDa。HSP78分子作为分子伴侣能与细胞中各种短肽结合。目前已证实gp96和HSP78分子可以结合多种组织特异性抗原多肽,包括泡状口炎病毒抗原区肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒抗原肽等。

在细胞外，gp96可将结合的短肽交叉呈递给I类MHC分子，从而激活CD8+T细胞，引发机体细胞免疫反应。gp96还可以活化树突细胞(DC)促进MHCI类和MHCII类分子以及共刺激因子的表达，从而提高免疫反应。因而gp96-多肽复合物是优良的细胞免疫激活剂。

肿瘤自体gp96因为携带有患者自身肿瘤的抗原肽，可以激活患者个体特异性的T细胞反应，从而杀伤肿瘤细胞，已成功应用于黑色素瘤、神经胶质瘤等的临床治疗。而宫颈癌相关的临床应用未见报道。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是克服肿瘤细胞免疫编辑导致的低下的免疫反应，能够在宫颈癌患者中诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(杀伤性T细胞，CTL)，利用CTL的特异性杀伤能力治疗和预防宫颈癌，同时对正常细胞及组织无破坏作用。

本发明的一个目的是提供一种与gp96和HSP78结合的多肽形成的抗宫颈癌复合物。所述的多肽可以分别是宫颈癌相关乳头瘤病毒E6抗原蛋白上第25-33位的氨基酸序列，其序列可以是ELQTTIHEI，或其变异序列；乳头瘤病毒E6抗原蛋白上第29-37位的氨基酸序列，其序列可以是TIHEIILEC，或其变异序列；乳头瘤病毒E6抗原蛋白上第110-118位的氨基酸序列，其序列可以是CINCQKPLC，或其变异序列。

本发明的复合物既包括热休克蛋白以非共价键与多肽结合形成的复合物，又包括热休克蛋白以共价键与多肽结合形成的复合物。本发明提供了制备本发明中如上所述抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物的方法。

本发明所诉的表位肽可以以热休克蛋白复合物形式在HLA-A2转基因小鼠中诱导形成特异性的CTL。

本发明所诉的表位肽可以在体外单独或以热休克蛋白复合物形式刺激HLA-A2阳性宫颈癌患者PBMC分泌IFN-γ，且这种作用在自体gp96免疫后显著增强。

本发明所诉的表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式提高HLA-A2阳性宫颈癌患者特异性T细胞反应。