[发明专利]一种油菜根系细胞质膜纯化和鉴定的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物生物化学技术领域，具体涉及一种油菜根系细胞质膜的分离纯化和质膜蛋白的鉴定及其应用，本发明提供了一个用于分离纯化油菜根系质膜的技术体系及其在膜蛋白质组学研究中的应用方法。

背景技术

质膜(plasmamembrane,PM)是区分许多重要的生理生化过程的细胞内部与周围环境的动态屏障，调节细胞与其所处的环境之间进行细胞物质交换和信息传递。质膜位置的特殊性赋予质膜上的质膜蛋白在信号传导、离子和代谢物的跨膜运输中起着非常关键的作用。在植物中，质膜蛋白除了上述功能外，对植物细胞壁的形成、生物病原体和致病菌的侵染以及非生物逆境的胁迫等都起着重要的信号传导与调控作用(SmallwoodM,KnoxJP,BowlesDJ.Membranes:specializedfunctionsinplants.BIOSScientificPublishers,Oxford.,1996,p578)。然而，质膜蛋白具有疏水性强、蛋白丰度低等特征，从而使得质膜蛋白组学研究举步维艰。到目前为止，进行质膜蛋白组分析的有效方法是先通过特定的方法将质膜从组织中富集纯化出来，然后再对所富集的质膜进行蛋白分析(YadetaKA,ElmoreJM,CoakerG.AdvancementsintheanalysisoftheArabidopsisplasmamembraneproteome.FrontPlantScience,4:86；DrissiR,DuboisML,BoisvertFM.Proteomicsmethodsforsubcellularproteomeanalysis.FEBSJournal,280:5626-5634)。

传统的膜分离方法主要是基于细胞内各种膜组分之间的大小和密度不同，通过差速离心及密度梯度离心获得质膜组分，然而通过这种方法获得的质膜纯度不高，因为在离心过程中沉降速率相似的膜组分都会富集到一起，Sze(SzeH,Nigericin-stimulatedATPaseactivityinmicrosomalvesiclesoftobaccocallus.Pro.Natl.Acad.Sci.USA.1980,77:5904-5908)进一步在密度梯度离心过程中引入葡聚糖(Dextran)以代替蔗糖进行膜组分的分离。之后便出现了基于膜表面的表面静电学特征以及膜的亲水性/疏水性进行细胞膜分离的两相体系。通过比较两相分配体系与蔗糖梯度离心对燕麦根系质膜组分的分离发现，两相分配体系法获得的质膜纯度远比蔗糖梯度离心法高(HodgesTK,MillsD.Isolationoftheplasmamembrane.MethodsinEnzymology,PlantMolecularBiologyAcademicPress,41-54)。目前，质膜分离纯化的两相分配体系主要由葡聚糖(DextranT-500)和聚乙二醇(PEG3350)构成，但不同的植物在质膜纯化过程中对聚合物浓度的要求与配比存在很大的差异。

油菜是世界上最重要的油料作物之一，在我国已成为继水稻、玉米、小麦、大豆之后的第五大作物。根系是植物吸收水分和无机养分的主要器官，研究油菜根系质膜蛋白的变化对解析优良根构型的发生发育、养分吸收和运转的生理分子机理具有重要的意义。而质膜蛋白组的研究是当今科学研究中的难点，因质膜蛋白具有丰度低、疏水性强等特点，油菜的根系质膜蛋白研究更是未见报道。因此，发展一种高效分离纯化油菜根系质膜的技术体系，以获得高纯度的根系质膜，是开展油菜根系质膜蛋白质组学研究的先决条件。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种油菜根系质膜纯化的技术体系，获得高纯度的油菜根系质膜以用于质膜蛋白质组学的研究方面。

本发明人通过研究两相分配体系中聚合物浓度对甘蓝型油菜根系质膜纯化的影响，获得了适合甘蓝型油菜根系质膜纯化的两相纯化系统，经质膜特异的ATPase酶抑制剂和蛋白分析对纯化的质膜进行纯度鉴定，结果表明该系统获得的质膜具有较高的纯度，适合进行膜蛋白质组学研究。

实现本发明目的的技术方案如下：