[发明专利]一种生产猪源脂联素的方法

权利要求书

1.一种生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

1)可分泌表达sumo蛋白酶的操纵子、可分泌表达酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素融合蛋白的操纵子的合成，包括以下步骤：

a)人工合成含枯草芽孢杆菌麦芽糖诱导的Pglv启动子、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和编码sumo蛋白酶的表达操纵子基因的融合DNA片段SEQ ID No.1；

b)人工合成枯草芽孢杆菌高效启动子P43、编码枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽sacB和含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与猪源脂联素的融合蛋白表达操纵子基因的融合DNA片段SEQ ID No.2；

2)猪源脂联素母体基因可在枯草芽孢杆菌表达的载体pZLS-128的构建，包括以下步骤：

将所述步骤中a)中人工的DNA片段SEQ ID No.1用BamHI和SacI双酶切，将所述步骤b)中人工合成的DNA片段SEQ ID No.2用BamHI和BglII双酶切，依次构建入载体pGJ222，构建成命名为pZLS-128的质粒；

3)重组表达载体pZLS-128在枯草芽孢杆菌WB700中的转化；

4)重组枯草芽孢杆菌BZLS-128在摇瓶中的诱导表达。

2.一种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤3)中重组表达载体pZLS-128在枯草芽孢杆菌WB700中的转化包括以下步骤：

将枯草芽孢杆菌WB700感受态细胞与质粒pZLS-128混合并将混合物转移至2mm电转杯，在2.5kV、5ms条件下电击；之后立即加入1000μl预冷的枯草芽孢杆菌电转恢复培养基RM，于37℃、225rpm条件下恢复培养1h；5000rpm离心后将管底菌体均匀涂布于含有5μg/ml氯霉素的LB固体平皿上，培养皿放置于37℃培养至单菌落出现；挑取单菌落置于LB液体培养基振荡培养被提取质粒进行EcoRI和SacI双酶切鉴定和测序鉴定；将鉴定正确的单菌落定义为BZLS128。

3.一种如权利要求1所述的生产猪源脂联素的方法，其特征在于所述步骤4)中重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株在摇瓶中的诱导表达包括以下步骤：

将筛选得到重组枯草芽孢杆菌BZLS128菌株的阳性转化子接种到25ml的LB液体培养基中，于30℃、225rpm的条件下振荡培养8～12h至595nm波长处的吸光值OD595达到2～4，之后加入5ml质量百分比浓度为30％的麦芽糖溶液进行诱导表达；接着于25℃、225rpm的条件下再继续振荡培养36～48h，12000rpm离心10分钟收集培养液上清，即为获得的猪源脂联素蛋白。