[发明专利]一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的PCR-RFLP引物及方法

说明书

本发明公开了一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的PCR‑RFLP引物及其方法，所述引物为上游引物引物P1：5’‑CAATTGAGGACATGGCTAAGAAA‑3’，下游引物P2：5’‑TCAGAGASCCRTCRAAWCCAGAAA‑3’，该方法是利用鸭肝炎病毒1型和新血清型基因编码区所含有的酶切位点差异来进行区别的，包括RNA的提取，RT‑PCR扩增得到相应的目的片段后，XhoⅠ酶切后进行RFLP分析。本发明鉴定方法操作简单快速，准确率高。

技术领域

本发明属于兽医传染病快速诊断技术领域，具体涉及一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的PCR-RFLP引物及其方法。

背景技术

鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）是由鸭肝炎病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害3周龄内雏鸭，以肝炎为典型特征。该病发病急、病程短、发病率和死亡率高，严重威胁养鸭业健康发展[杨维星，施少华，陈红梅，等．3株鸭肝炎病毒1型全基因序列分析[J]．中国农学通报，2010，26（14）：8-12．]。

1999年中国农业大学苏敬良等从发病的北京鸭和樱桃谷鸭中分离到2株与鸭肝炎病毒1型无血清学相关性的鸭肝炎病毒新血清型（Duck hepatitis virus new serotype,DHV-N）。本研究室施少华等以苏敬良等惠赠的鸭肝炎病毒新血清型DHV-N G株进行了基因组序列测定，发现鸭肝炎病毒新血清型G株和鸭肝炎病毒1型的5’UTR和3’UTR相比，发生了较大的插入与缺失现象，并明确鸭肝炎病毒1型和新血清型存在较大差异[施少华，程龙飞，傅光华，等．鸭肝炎病毒新血清型基因组序列分析[J]．微生物学报，2009，49（3）：309-315．]。

目前，关于鸭肝炎病毒1型和新血清型病原学检测的PCR方法和荧光定量方法均有相关报道。但相关方法均需要分别针对鸭肝炎病毒1型和新血清型设计特异性引物，建立双重PCR检测，但双重PCR条件优化较为繁琐。本发明提供的方法仅需一组引物（比分别设计特异性引物检测时少1组引物）结合酶切位点差异进行RFLP分析，无虚复杂繁琐的条件优化过程，本发明在鸭肝炎病毒1型和新血清型病原学检测上快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的PCR-RFLP引物及方法。该引物能有效区分鸭肝炎病毒1型和新血清型感染（或共感染），为水禽养殖业健康养殖提供技术保证。

本发明根据鸭肝炎病毒1型和新血清型基因组中序列特征，设计一组引物能同时对鸭肝炎病毒1型和新血清型进行RT-PCR产阳性扩增，根据鸭肝炎病毒新血清型扩增RT-PCR产物中有特异性的XhoⅠ酶切位点，而鸭肝炎病毒1型扩增RT-PCR产物中没有XhoⅠ酶切位点（见图1），来对建立一种对鸭肝炎病毒1型和新血清型进行快速检测的PCR-RFLP方法。

从图1可以看出，鸭肝炎病毒1型在此处均为CAAGAG, 鸭肝炎病毒新血清型均为CTCGAG，刚好为的XhoⅠ酶识别酶切位点。

本发明采用以下技术方案：

一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的PCR-RFLP方法，包括以下步骤：

（1）提取鸭肝炎病毒1型和新血清型核酸RNA；

（2）用引物P1和P2同时对鸭肝炎病毒1型和新血清型进行RT-PCR扩增，得到相应的目的基因片段；

（3）取PCR产物经XhoⅠ酶切后进行RFLP分析。

其中，PCR引物需满足如下要求：

（1）该PCR产物需选择鸭肝炎病毒1型和新血清型编码区基因中的保守区域进行设计，以便能一个RT-PCR反应能对鸭肝炎病毒1型和新血清型核酸RNA均能进行RT-PCR扩增，并获得相同大小的目的基因片段；