[发明专利]SEI单克隆抗体的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，具体地，涉及一种SEI单克隆抗体的制备方法及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxins，简称SEs)，是由金黄色葡萄球菌产生，能引起人类食物中毒、呕吐腹泻、休克的重要致病因子。目前已发现的肠毒素有23种血清型，其中SEI属于新型肠毒素，其理论分子量为24.928KD，由729个核苷酸构成，表达一个具有242个氨基酸残基的成熟蛋白质。据调查显示，在致病性金黄色葡萄球菌基因型检测中，sei基因检出率高达89.5％。基于sei基因流行的广泛性，新型肠毒素SEI潜在威胁人类健康。因此，利用SEI单克隆抗体建立SEI免疫学检测法，对监测和预防由SEI引起的食物中毒具有重要意义。

传统免疫动物方法制备抗体的效率低，产量有限，并且其产生的血清多克隆抗体为多种抗体的混合物，这种多克隆抗体与抗原反应的特异性不高，重复性低。单克隆抗体理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合特异性强，便于人为处理和质量控制，是免疫学领域的重大突破。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提一种SEI单克隆抗体的制备方法，通过该方法所制备的SEI单克隆抗体效价高、性质稳定、特异性强。

此外，本发明还提供一种SEI单克隆抗体的应用。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：SEI单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：以重组SEI免疫BALB/c小鼠，再用小鼠的脾细胞直接与骨髓瘤细胞融合，采用间接酶联免疫吸附法筛选产SEI单克隆抗体的优势杂交瘤细胞株，得到SEI单克隆抗体。

SEI具体是指金黄色葡萄球菌新型肠毒素I，SEI潜在威胁人类健康，因而我们需要对SEI进行检测，普通的检测方法检测速度较慢，耗时较长，采用SEI单克隆抗体进行检测操作简单，能够快速检测到SEI，本发明在制备SEI单克隆抗体的方法中，采用重组SEI作为免疫原，重组SEI具有免疫原性，能够直接激发免疫细胞产生特异性抗体，具有多个抗原决定簇，将其直接作为免疫原作用于BALB/c小鼠制备单克隆抗体，可以同时制备出多种具有不同抗原决定簇的单克隆抗体，用于构建双单抗夹心ELISA方法检测毒素蛋白SEI。

实验证明，通过本发明所述方法制备的SEI单克隆抗体效价高、性质稳定、纯度高、特异性强、亲和力高。

进一步地，重组SEI蛋白的制备与纯化过程为：以金黄色葡萄球菌的DNA为模版进行PCR扩增，获得sei基因完整片段，测序后采用EcoR1和SalI分别酶切PCR产物和pET-28a(+)，连接，筛选获得重组质粒pET-28a-SEI，重组质粒pET-28a-SEI在表达场所内进行表达，表达菌株进行培养、离心收集细胞菌体，再将细菌菌体超声破碎，离心弃沉淀，上清进行过镍琼脂糖亲和层析、阳离子交换层析纯化收集，进一步浓缩，获得纯化的SEI重组蛋白。所述sei基因在GenBank中的accessionnumber为KT853046。

目前，蛋白的合成主要包括人工合成多肽以及用现有DNA模板依次进行PCR扩增、酶切、测序、质粒重组、重组质粒进行细胞表达得到细胞菌体，细胞菌体进行纯化得到重组蛋白，其中，通过人工合成的多肽分子量小，仅有一种抗原决定簇，因此由其制备的单克隆抗体种类单一，并且人工合成的多肽为半抗原，由于半抗原缺乏免疫原性，不能直接激发免疫细胞产生特异性抗体，因此，必须将半抗原与小鼠钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)和牛血清蛋白(BSA)偶联作为免疫原才能得到特异性抗体，操作麻烦，本发明的SEI重组蛋白采用的是以金黄色葡萄球菌的DNA为模版进行PCR扩增，获得SEI的完整基因序列(accessionnumber:KT853046)，用EcoR1和SalI分别酶切PCR产物和pET-28a(+)、连接，筛选获得重组质粒pET-28a-SEI，通过本发明制备的SEI重组蛋白能直接激发免疫细胞产生特异性抗体，并且可以同时制备出多种具有不同抗原决定簇的单克隆抗体，可以用于构建双单抗夹心ELISA检测法。

进一步地，重组的pET-28a-SEI质粒的表达场所为大肠杆菌BL21。

进一步地，优势杂交瘤细胞株采用辛酸-饱和硫酸纯化腹水，透析后得到SEI单克隆抗体。本发明的纯化抗体的方法操作简单，不需特殊仪器，且蛋白损失小，纯化效果较为理想。

进一步地，重组SEI与等量完全或不完全弗氏佐剂混合搅拌法将其乳化，乳化完全后用于免疫BALB/c小鼠。