[发明专利]磷酸替米考星的免疫胶体金检测卡及其制备方法

说明书

技术领域

本发明可有效用于测定抗生素磷酸替米考星，方法简单，方便，快捷，结果准确。

背景技术

磷酸替米考星具有与大环内酯类药物相似的抗菌活性，对革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌及支原体有效，药效学抗菌作用与泰乐菌素相似，主要抗革兰氏阳性菌，对少数革兰氏阴性菌和支原体也有效。其对胸膜肺炎放线杆菌、巴斯德氏菌及畜禽支原体的活性比泰乐菌素强。据报道有95%的溶血性巴斯德氏菌菌株对本品敏感。主用于防治敏感菌引起的牛肺炎和乳房炎，也用于猪、鸡的支原体病。近几年我国畜产品污染和有毒、有害物质残留问题相当严重，而动物性食品中的兽药残留是其中最重要和最常见的污染物。兽药残留不仅直接影响人体健康，引起细菌耐药性增加，给生态环境带来不良影响，它还可通过环境和食物链作用对人体健康造成潜在危害，从而影响养殖业的发展，和走向国际市场。因此必须采取有效措施，减少和控制兽药残留的发生。

目前，检测磷酸替米考星残留量的方法主要是高效液相色谱法(HPLC)，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程以及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查。

发明内容

针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术的缺陷，而提供一种磷酸替米考星的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速有效的检测出抗生素磷酸替米考星的问题。

本发明的磷酸替米考星的胶体金的检测卡包括单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了磷酸替米考星-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。

本发明的磷酸替米考星胶体金检测卡的制备方法由以下步骤实现：

（1）胶体金溶液制备：取1L三角烧瓶2个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸5 ml，制成500 ml 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠溶液5-7ml，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用

（2）抗体的预处理：将要标记的磷酸替米考星抗体在1000r/mi n，4℃条件下，离心20min，取上清，用0.01mol/LPBS稀释成l mg/ml；或者0.01mol/L,PBS稀释成l mg/ml，过0.22um滤膜；

（3）胶体金标记物的制备：取步骤（1）中的胶体溶液40 mL，用0.25mol／LK₂C0_3, ，调节胶体金溶液PH至8.5，电磁搅拌器250 r／min搅拌。逐滴加入4ml含0.3mg抗体蛋白的蛋白溶液。反应10 min；逐滴加入4 mL l0％BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温1500r/min离心10min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000 r/min离心20 min，弃上清，收集沉淀定，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1mL，制备成磷酸替米考星单克隆抗体胶体金标记物：

（4）胶体金膜的制备：将步骤（3）磷酸替米考星单克隆抗土胶体金标记物用划膜仪以5/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3h，制成含磷酸替米考星单克隆抗土胶体金标记物的胶体金膜；

（5）包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体磷酸替米考星蛋白质偶联物稀释成1mg/mL,用划膜仪依次以1/cm的浓度喷涂在硝酸纤维膜上，制备成包被膜，37℃包被2h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

（6）样品垫前处理；将样品垫前处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

（7）检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫，胶体金膜，包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

所述的磷酸替米考星胶体金检测卡，起特征在于所述步骤（5）中所包被的检测线T设在质控线C的下方。

所述步骤（6）中样品垫处理液是由1g小牛血清（BSA）和0.8g氯化钠（NaCl）,用含有0.5%TRITON-100的0.01mol/L PBS定容至100mL。

附图说明

图1为本发明磷酸替米考星的免疫胶体金检测卡的结构图：图1.加样孔 2.检测线 3.质控线 4.检测孔 5.试纸条 6.检测卡外壳；