[发明专利]一种来源于海洋生物的细菌Pseudoalteromonas.sp.QJ97及用其生产琼胶酶的方法

说明书

本发明的目的是提供一种来源于海洋生物的微生物菌株Pseudoalteromonas.sp.QJ97，该菌株具有营养要求范围低，容易培养和培养时间短等特点。用本发明的菌株作为琼胶酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，适于工业化生产。通过酶的分离纯化，SDS‑PAGE确定该菌株产生的褐藻胶裂解酶的分子量分别为35 kDa。

技术领域

生物技术。

背景技术

琼胶是一种从江蓠、石花菜、紫菜等红藻类(Rhodophyceae) 海藻细胞壁中提取出来的具有高凝胶强度的细胞间多糖，由琼脂糖和硫琼胶组成。琼脂糖是由α-D-半乳糖和3,6-内醚-α-L-半乳糖以α-1,3 和β-1,4 糖苷键交替连接形成的线性大分子；硫琼胶由半乳糖残基组成糖链，并交联了硫酸基、甲基、丙酮酸等取代基。琼胶酶可催化水解琼脂糖分子内的糖苷键，基于所催化糖苷键的类型差异,可以把琼胶酶分为2种：一种是α-琼胶酶(E.C.3.2.1.158)，作用于琼脂糖的α(1→3)糖苷键，产物为以3,6-内醚-α-L-半乳糖为还原性末端的琼寡糖(Agaro-oligosaccharide)系列，包括琼二糖、琼四糖等系列寡糖；另一种是β-琼胶酶(E.C.3.2.1. 81)，作用于琼脂糖的β(1→4)糖苷键，产物为以D-半乳糖为还原性末端的新琼寡糖(Neoagaro-oligosaccharide)系列，包括新琼二糖、新琼四糖等系列寡糖。研究表明，琼胶酶的作用机理大体可分为三种：第一种，由内切β−琼胶酶裂解琼胶的β−1,4 糖苷键，形成新琼四糖，进而被外切β−琼胶酶降解为新琼二糖，最后新琼二糖酶将其分解为半乳糖和 3,6−内醚−α−L−半乳糖。第二种，胞外的α−琼胶酶作用于α-1,3−糖苷键，形成非还原性末端为 D−半乳糖残基的琼二糖系列寡糖。第三种，琼胶酶的蛋白体结合两条寡糖链，一条寡糖链上的四个糖单体结合在蛋白体的活性部位；另一条寡糖链有八个糖单体与蛋白体相连处在与催化活性部位相对应平行的部位上。微生物来源的琼胶酶产生菌主要是海洋细菌，包括假单孢菌属(Pseudomonas sp.)、交替单孢菌属(Alteromonassp.)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)、噬琼胶菌属(Agarivoranssp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、噬细胞菌属(Cytophagasp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、产微球茎菌属(Microbulbifer sp.)、桃色杆菌属(Persicobactersp.)、盐杆菌属(Salegentibacter sp.)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)等。Pseudomonas是重要的产生琼胶酶的菌属，产生的琼胶酶也有多种酶，酶的分子量是琼胶酶重要的性质表征，它代表了不同酶蛋白的分子大小，也是描述酶学性质的重要指标。王静雪报道Alteromonas sp.琼胶酶分子量39.5kDa，刘美英报道Actinobacillusgenus琼胶酶分子量85kDa，唐中秀报道Paenibacillus sp. 琼胶酶分子量30kDa，马怡茗等研究Pseudoalteromonas sp. 琼胶酶分子量50.4kDa，李京宝报道Pseudoalteromonas sp. 琼胶酶分子量51kDa，吴倩倩报道Pseudoalteromonas sp. 琼胶酶分子量50.8kDa等等。 本案发明人从采自海洋动物锈凹螺样品中筛选出一株高产琼胶酶菌株，依据形态学特征和16Sr DNA序列分析，初步鉴定其属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)，命名为Pseudoalteromonassp. QJ97。通过酶的分离纯化，SDS-PAGE确定了该菌株产生的琼胶酶的分子量为35 kDa。经查阅资料、检索文献可知，该琼胶酶的分子量不同于以往的报道。