[发明专利]一种敲除argCJBD提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种敲除argCJBD提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。然而，在氨糖合成过程中，L-Gln作为乙酰氨基葡萄糖合成的氨基供体，其代谢流被L-Pro和L-Arg竞争性削弱。

发明内容

本发明首先提供一种敲除了argCJBD的重组枯草芽孢杆菌，是以BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株，敲除了argC、argJ、argB、argD，阻断宿主菌由谷氨酸生成精氨酸的途径，构建而成的重组枯草芽孢杆菌。

所述BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1，是以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子P_xylA、P₄₃控制glmS、GNA1的重组表达。

在本发明的一种实施方式中，重组枯草芽孢杆菌BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1的构建方法参见文献Liu,Y.etal.ModularpathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamineproduction.Metab.Eng.23:42-52,2014。

所述由谷氨酸生成精氨酸的途径，包括乙酰谷氨酸半醛脱氢酶、鸟氨酸乙酰转移酶、乙酰谷氨酸激酶、乙酰鸟氨酸转氨酶。

所述乙酰谷氨酸半醛脱氢酶编码基因如NCBI-GeneID:936389所示，鸟氨酸乙酰转移酶编码基因如NCBI-GeneID:939800所示，乙酰谷氨酸激酶编码基因如NCBI-GeneID:936381所示，乙酰鸟氨酸转氨酶编码基因如NCBI-GeneID:939357所示。

本发明还提供了构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法，是以BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株，通过同源重组敲除了argCJBD，阻断宿主菌由谷氨酸生成精氨酸的途径。

本发明还提供了应用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，将37℃、200rpm下培养12h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，同时加入5g/L木糖作为诱导剂，于37℃、200rpm条件下发酵30h。

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。

发酵培养基(g/L)：Glc60，酵母粉6，NH₄SO₄7.74，K₂HPO₄·3H₂O12.5,KH₂PO₄2.5，CaCO₃5，MgSO₄3，微量元素15ml/L。