[发明专利]番茄灰叶斑病病原菌的分离方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病原菌分离技术领域，尤其是一种番茄灰叶斑病病原菌的分离方法。

背景技术

番茄灰叶斑病是匍柄霉属(StemphyliumWallroth)引起的一种真菌病害，该属真菌常寄生于多种植物的叶、种子或果实上，可引起大蒜、苜蓿、莴苣、番茄、甘蓝、扁豆、辣椒等蔬菜和其他多种植物病害。目前，我国番茄病害近70种，而对于番茄灰叶斑病发生的国内报道过去比较少见。然而，近年来随着设施番茄栽培面积的不断扩大、频繁引进国外品种及主栽品种的更换，使得该类病害在一些番茄种植基地流行为害逐年偏重。该病害近几年在内蒙古赤峰地区也开始出现，造成多地番茄产区大面积减产，严重制约着番茄生产。因此，对番茄灰叶斑病的研究是非常必要的，而病原菌的分离是进行研究的基础和前提，本研究针对番茄灰叶斑病病原菌的分离方法进行研究，旨在发现一种新的病原菌的分离方法，为后续试验奠定良好的基础。

现有技术中，分离提取番茄灰叶斑病病原菌的常规方法是：从发病部位的病健交界处切取5mm×5mm的组织块，经75％乙醇消毒，在无菌水中漂洗3次后将组织块移到PDA平板中，在25℃黑暗条件下培养，待长出菌落后，通过挑取菌落边缘菌丝体或者单孢分离的方法对病原菌进行纯化和转接培养。这种分离方法的缺点是：番茄灰叶斑病菌不能一次性分离成功，有的标本需要进行二次甚至多次分离才能分离出目标菌，污染率高，要经过多次纯化才可以得到纯净的目标菌落。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种番茄灰叶斑病病原菌的分离方法，该方法分离步骤简单易操作，一次性分离成功，分离出的病原菌污染率低，无杂菌，易纯化。

本发明的技术方案如下：一种番茄灰叶斑病病原菌的分离方法，它包括如下步骤：

(1)取番茄灰叶斑病标本的病斑部位，用吸耳球吹去病斑部位的灰尘等杂质；

(2)将除尘后的番茄灰叶斑病标本的病斑部位置于体式显微镜下，调整放大倍数能清楚地看到病原菌菌丝，将接种钩在酒精灯上烧至泛红后冷却，直接挑取病部的病原菌菌丝，接种至PDA斜面培养基上；

(3)将接种的PDA斜面培养基在24～26℃黑暗条件下培养，待长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝体进行转接培养。

进一步，本发明所使用的PDA斜面培养基由如下重量份的原料制成：马铃薯180～220份，葡萄糖18～22份，琼脂15～20份，水1000份。

进一步，每个番茄灰叶斑病标本接种10管PDA斜面培养基。

本发明的优点为：

(1)直接挑取病原菌菌丝进行分离，操作更直接，更具针对性，分离成功率能达到100％；

(2)分离步骤简单，易操作，分离病原菌所用时间短，降低了杂菌感染的几率；

(3)本发明的方法分离时，由于只挑取病原菌菌丝，剔除了病部组织携带其他杂菌的可能，得到的分离物更纯净。

(4)采用本发明的方法对病原菌进行分离，可以短时间内获得纯净的目标菌。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做具体说明。

实施例：一种番茄灰叶斑病病原菌的分离方法，它包括如下步骤：

(1)配制PDA斜面培养基：在1000ml蒸馏水中，加入马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g；经过煮沸、溶解、过滤并分装到试管内制得PDA斜面培养基。

(2)取番茄灰叶斑病标本的病斑部位，用吸耳球吹去病斑部位的灰尘等杂质；

(3)将除尘后的番茄灰叶斑病标本的病斑部位置于体式显微镜下，调整放大倍数能清楚地看到病原菌菌丝，将接种钩在酒精灯上烧至泛红后冷却，直接挑取病部的病原菌菌丝，接种至PDA斜面培养基上，每标本接种10管PDA斜面培养基；

(4)将接种的PDA斜面培养基在25℃黑暗条件下培养，待长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝体进行转接培养。

通过本实施例的方法对下乡采回的10个番茄灰叶斑病标本进行了病原菌的分离，结果表明，采用本发明的方法分离病原菌，分离步骤简单易操作，所有标本均为一次性分离成功，分离成功率达100％，分离出的病原菌污染率低，无杂菌，易纯化。