[发明专利]一种表达NAD(P)H氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达NAD(P)H氧化酶提高重组枯草芽孢杆菌乙酰氨基葡萄糖产量的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。

发明内容

本发明首先提供一种表达NAD(P)H氧化酶的重组枯草芽孢杆菌，乙酰氨基葡萄糖的产量提高。所述重组枯草芽孢杆菌以BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株，同时整合表达内源NAD(P)H氧化酶。

所述BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1，是以B.subtilis168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子P_xylA、P₄₃控制glmS、GNA1的重组表达。

所述整合表达是以强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达，通过同源重组替换基因组上非必需区域skin。非必需区域skin在Bacillussubtilis168基因组NC_000964.3上的位置为2654942-2701732bp。

在本发明的一种实施方式中，重组枯草芽孢杆菌BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1的构建方法参见文献Liu,Y.etal.ModularpathwayengineeringofBacillussubtilisforimprovedN-acetylglucosamineproduction.Metab.Eng.23:42-52,2014。

所述NAD(P)H氧化酶的编码基因yodc如NCBI-GeneID:939506所示。

本发明还提供一种构建所述重组枯草芽孢杆菌的方法，是BSGN6-P_xylA-glmS-P₄₃-GNA1为出发菌株，通过同源重组在基因组上以强启动子P43控制NAD(P)H氧化酶基因yodc表达。

本发明还提供了一种应用所述重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，将37℃、200rpm下培养12h的种子以5％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养30h。

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl10。

发酵培养基(g/L)：Glc60，酵母粉6，NH₄SO₄7.74，K₂HPO₄·3H₂O12.5,KH₂PO₄2.5，CaCO₃5，MgSO₄3，微量元素15ml/L。

微量元素溶液(g/L)：MnSO₄·5H₂O1.0，Cocl₂·6H₂O0.4，NaMoO₄·2H₂O0.2，ZnSO₄·7H₂O0.2，Alcl₃·6H₂O0.1，Cucl₂·H₂O0.1，H₃BO₄0.05，含5MHCl。