[发明专利]一种定量检测猪口蹄疫病毒的免疫荧光试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速定量检测猪口蹄疫病毒的免疫荧光试纸条及其制备方法。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus， FMDV）感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、 接触性传染病，最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等；黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。口蹄疫病毒目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非 1、2、3型）和Asia1（亚洲1型）7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。 FMDV属于小RNA病毒科口疮病毒属，是偶蹄类动物高度传染性疾病（口蹄疫）的病原。在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。FMDV在病畜的水泡皮内和淋巴液中含毒量最高。在发热期间血液内含毒量最多，奶、尿、口涎、泪和粪便中都含有FMDV。口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美均有流行，在非流行区也有散发病例。

口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水疱，高烧不退，使实际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的“头号杀手”。因此，检测通过有效方法检测猪口蹄疫病毒刻不容缓。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明通过研究，制备了一种特异性高、灵敏度高的纳米抗体（抗FMDV单域抗体），并基于此抗体制备了一种能够快速定量检测猪口蹄疫病毒的免疫荧光检测试纸条。

本发明的目的在于提供一种快速定量检测猪口蹄疫病毒的免疫荧光试纸条。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速定量检测猪口蹄疫病毒的免疫荧光试纸条，包含附着于底板上且依次紧密相连的样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫；所述结合垫上含有荧光微球标记的抗FMDV单域抗体；所述层析膜上设置有一条检测线和一条质控线，检测线靠近结合垫，质控线靠近吸水垫，检测线上包被有抗FMDV的多克隆抗体，质控线上包被有能与荧光微球标记的抗FMDV单域抗体结合的蛋白；

其中所述的抗FMDV单域抗体为上述所述的单域抗体。

进一步的，上述质控线上包被的能与荧光微球标记的抗FMDV单域抗体结合的蛋白为兔抗双峰驼IgG。

进一步的，上述样品垫为玻璃纤维膜。

进一步的，上述层析膜为硝酸纤维素膜。

进一步的，上述吸水垫为吸水纸。

进一步的，上述质控线和检测线之间的距离为4. 5~5. 5mm 。

进一步的，上述质控线用0. 5~ 1. 5mg/mL兔抗双峰驼IgG进行包被，用量为1μL/cm。

进一步的，上述检测线用0. 8~1. 2 mg/ml抗FMDV多克隆抗体包被，用量为2μL/cm。

本发明的有益效果是：

1）本发明制备的免疫荧光快速试纸技术是应用纳米荧光颗粒（荧光微球标记的FMDV单域抗体）构建出一种可定性同时定量的快速检测试纸。操作者无需培训和专业知识，操作简单，5~10分钟即可获得结果，若与荧光定量仪连用，可实现定量检测，同时该技术灵敏度明显优于传统的胶体金检测试纸技术，具有广阔的市场前景。

2）抗体作为免疫试纸条检测技术的核心部分，其特异性及亲和力决定了测定结果的准确性和灵敏度。本发明采用了特定制备的高灵敏的、FMDV特异性的单域重链（VHH）抗体，研制成检测FMDV病原的快速检测试纸，目前在国内外均未见报道。

附图说明

图1为实施例1中RT-PCR扩增VHH基因片段的结果图；

图2为SDS-PAGE检测FMDV单域抗体的结果；

图3为FMDV免疫荧光快速检测试纸条的结构示意图，其中1为塑料底板，2为样品垫，3为结合垫，4为硝酸纤维素膜，5为吸水纸，6为检测线T， 7为质控线C。

具体实施方式

实施例1猪口蹄疫病毒重链单域抗体的制备

1）动物免疫

在双峰驼颈背部皮下和双侧后腿皮下进行多点接种FMDV灭活疫苗。首次免疫剂量为1mL/头，共2头；7天后二免，2 mL/头；之后间隔14天免疫一次，每次免疫4 mL，共免疫3次，全程共免疫5次。最后一次免疫后7天采血500 mL分离淋巴细胞，提取总RNA进行下一步实验。