[发明专利]检测恶喹酸的时间分辨免疫荧光试剂盒制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种时间分辨免疫荧光试剂盒，尤其涉及一种检测恶喹酸时间分辨免疫荧光试剂盒；此外，本发明还涉及该检测恶喹酸的时间分辨免疫荧光试剂盒的制备方法和应用。

背景技术

恶喹酸是一种喹诺酮类抗菌药物，主要通过抑制DNA一螺旋酶，影响DNA的正常形态与功能而达到抗菌的目的。对治疗革兰氏阴性菌(特别是对大肠杆菌、支原体、嗜水气单胞菌)感染有较好疗效。但是，研究发现恶喹酸具有致癌、致突变等毒害作用。生产中违规使用恶喹酸可导致动物性产品中药物残留超标，对食用者造成危害，也严重影响产品的对外贸易。

近年来，免疫诊断方法已经广泛应用于医学和生物学领域的研究，免疫诊断技术主要有以下几种类型:荧光标记免疫技术、同位素标记免疫技术、酶标记免疫技术、胶体金标记免疫技术和发光免疫技术等。鼠源抗体常用于包被酶标板、芯片、胶体金颗粒、乳胶微球颗粒和磁性微球颗粒等固体载体上，然后用BSA (Bovine Serum Albumin，即牛血清白蛋白)或OVA (Ovalbumin，即鸡卵白蛋白)等其它蛋白封闭抗体未结合的载体位点，洗脱，从而完成了抗体的包被。抗体包被效果的判断标准是产品性能能否达到其设计要求或者判定标准。

由于产品的性能受到很多因素的影响，因此单纯地以产品性能能否达到设计要求或判定标准来判断在固体载体上抗体的包被效果并不科学。抗体结合在固体载体上的比率是反映抗体包被效果的一个非常重要的而且直接的指标，更直接地反映了抗体结合在固体载体上的具体抗体量，因此，还需开发一种抗体快速定量检测新产品。

时间分辨荧光免疫分析方法是1982年发展起来的一种新型的非放射性标记技术。TRFIA利用镧系元素金属的三价离子及其鳌合物作为荧光标记，常用的镧系元素为铕(Eu), 铽 (Tb),钐(Sm)和镝(Dy)，最常用的是铕、铽，镧系元素标记物比较稳定，可以保存1-2年，克服了同位素、酶标等不稳定的缺点。TRFIA现已成为免疫检测中一项非常有应用前景的分析手段，具有操作简便、灵敏度高、示踪物稳定、不受样品自然荧光干扰、多标记、无放射性污染等优点。在抗体检测方面，时间分辨荧光免疫分析方法的检测目标物通常是针对某一抗原包括小分子抗原的抗体，一般不会采用该方法来检测某一种属动物的抗体。目前，对于采用时间分辨荧光免疫分析方法定量检测恶喹酸尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测恶喹酸的时间分辨免疫荧光试剂盒，解决免疫诊断技术中定量检测未有效包被到固体载体上的恶喹酸浓度，从而计算有效包被到固体载体上的抗体包被率，以评估包被效果，该试剂盒能够定量检测恶喹酸，具有检测灵敏度高，操作简单，操作流程短，储存时间长等优点。此外，本发明还提供该试剂盒的制备方法和应用。

本发明的原理是竞争免疫荧光分析法，如图1所示，具体包括如下步骤:将羊抗鼠多克隆抗体包被到酶标板上，形成包被羊抗鼠多克隆抗体的酶标板1.待测样品中的恶喹酸2.先与包被在酶标板1.上的羊抗鼠多克隆抗体反应(震荡、洗板)，形成恶喹酸单克隆抗体/羊抗恶喹酸多克隆抗体免疫复合物3，然后加入镧系元素标记的恶喹酸单克隆抗体4反应(震荡、洗板)形成恶喹酸/羊抗恶喹酸多克隆抗体/镧系元素免疫复合物5，加入增强液震荡反应，在荧光检测设备如AutoDELFIA1235上读荧光信号，从而确定标准品中恶喹酸的浓度。当镧系元素离子在荧光增强液中从恶喹酸单克隆抗体上解离后发出强荧光，荧光强度与样品中的恶喹酸浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中恶喹酸的浓度，再按照公式“100%—恶喹酸浓度*待检样品体积/恶喹酸投入量*100%”计算恶喹酸的包被率。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种检测恶喹酸的时间分辨免疫荧光试剂盒，包括以下组分:

包被羊抗恶喹酸多克隆抗体的酶标板；

镧系元素离子标记的恶喹酸单克隆抗体标记物；

恶喹酸单克隆抗体校准品(浓度已知，用于建立标准曲线)；

清洗液(市售商品)；

分析液(市售商品)；

增强液(市售商品)。

作为本发明优选的技术方案，所述羊抗恶喹酸多克隆抗体的包被浓度为1-1001- g/ml。

作为本发明优选的技术方案，所述镧系元素标记的恶喹酸单克隆抗体标记物中抗体是恶喹酸单克隆抗体，所述标记示踪物是镧系元素金属离子及其鳌合物中的一种，包括铕(Eu), 铽 (Tb),钐(Sm)和镝(Dy)。