[发明专利]抗蓝舌病病毒12型NS1蛋白的单克隆抗体BTV12-NS1-1F8及其识别的B细胞表位和应用

说明书

技术领域

本发明一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，特别涉及一株分泌抗蓝舌病病毒12型NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及由上述单克隆抗体所识别的BTV12型NS1蛋白的线性B细胞表位以及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及线性B细胞表位在制备鉴别、诊断、预防或治疗蓝舌病病毒12型感染的相关试剂与药物中的应用，本发明属于蓝舌病的防治领域。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(BluetongueVirus，BTV)引起的反刍动物虫媒(如库蠓、伊蚊等)传染病。其临诊特征为发热、黏膜水肿和糜烂等炎症变化。世界动物卫生组织(OIE)将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为一类动物疫病。本病于19世纪在南非的绵羊中首次发现，1905年被命名为“蓝舌病”，由于BTV中存在大量的基因变异和抗原变异，到目前为止世界上已经发现26种BTV血清型，且各个血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护作用，这给BT的检测和防控带来了极大的困难。因此，尽早鉴别诊断爆发的BT血清型并在该病流行区域接种相应的疫苗是防治本病的关键。我国于1979年在云南首次发现BT流行，之后在湖北(1983年)、安徽(1985年)、四川(1989年)、山西(1991年)相继爆发本病；同时内蒙古、河北、广东、广西等10个省有BTV血清学阳性畜检出。在我国已经检测出BTV-1，2，3，4，12，15，16七个血清型，其中1型和16型是主要的致病血清型。因此，制备出特异性针对BTV12的Mab，针对BTV12建立一套行之有效的检测方法就显得十分必要。

蓝舌病病毒(BTV)与茨城病毒、鹿流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒同属环状病毒属。蓝舌病病毒为双股RNA病毒，呈20面体对称，直径为70-80nm，具有双层衣壳。基因组由10个大小不同的双股RNA组成，分别编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)。外壳蛋白包含VP2和VP5，诱导产生型特异性中和抗体。非结构蛋白(NS)负责控制BTV复制，成熟和出芽，其中NS1蛋白由S5基因编码,核苷酸长1689bp,编码552个氨基酸,蛋白大小为64kDa。S5基因在BTV感染宿主过程中具有遗传和和抗原稳定性。NS1蛋白是在BTV复制周期中表达量最高的细胞质蛋白，其多聚体能够在感染细胞内中形成大量的病毒特异性微管(直径52.3nm，1000nm)，上调包括NS1蛋白的所有病毒蛋白的合成，形成NS1表达的正反馈，进而迅速增加所有病毒蛋白的合成，使BTV感染哺乳动物后，病毒蛋白的合成能够迅速取代细胞蛋白的合成，在BTV引起细胞病变的过程中起重要作用。所以可以通过制备BTV12-NS1蛋白特异性的单克隆抗体并鉴定NS1蛋白的B细胞表位以建立BTV12的快速准确的鉴别诊断方法并进一步研究预防与治疗措施。

发明内容

本发明目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒12型(BTV12)NS1蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二是提供一种由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与BTV12NS1蛋白发生特异性反应；

本发明目的之三是提供一种BTV12NS1蛋白的线性B细胞表位。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12NS1蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以pET-30a原核系统表达纯化的重组NS1蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，最终获得一株能够稳定分泌抗BTV12NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV12-NS1-IF8，分类命名为分泌抗BTV12-NS1-IF8单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其微生物保藏号是：CGMCCNo.10207；保藏时间为2014年12月23日；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

此外，本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，命名为BTV12-NS1-1F8，IFA检测结果表明该单克隆抗体与重组BTV12NS1蛋白及感染BTV12的BHK-21细胞发生特异性反应，而与感染BTV1-11，BTV13-24的BHK-21细胞及相应阴性对照均不发生反应。