[发明专利]一种浓缩酵母发酵液中蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种浓缩酵母发酵液中蛋白的方法，属生物工程领域。该方法包括如下步骤：(1)用滤膜装填重力柱底部，加入色谱柱料，用超纯水洗脱介质中的乙醇；(2)用1.5‑3倍柱体积的硫酸铵平衡缓冲溶液平衡重力柱；(3)调节发酵液上清中硫酸铵终浓度为1‑1.7M，添加柱体积6‑8倍的发酵液上清溶液，加入平衡后的重力柱中，至含有硫酸铵的发酵液自行流出重力柱；(4)发酵液挂柱后，用2‑3倍柱体积硫酸铵平衡缓冲溶液洗脱挂柱发酵液中的杂质蛋白；(5)加入4倍柱体积的洗脱液对目标蛋白进行洗脱。本发明方法具有目标蛋白浓缩效率高、纯度显著提高，可用于实验室普通超滤管浓缩进行进一步的纯化，而不会发生堵塞的问题。

技术领域

本发明涉及一种浓缩发酵液中蛋白的方法，特别涉及浓缩酵母发酵液中蛋白的方法。属生物工程领域。

背景技术

酵母是一个优异的蛋白表达宿主，被广泛用于实验室研究和工业生产。酵母表达异源蛋白的时候可以采取胞外和胞内两种方式，由于胞外表达蛋白不需要破碎酵母细胞，而被广泛使用。

采用胞外表达的方式，后期处理的第一步即需要浓缩目标蛋白。现在常使用到的方法有：硫酸铵饱和沉淀、超滤杯浓缩和其他方法。其中，硫酸铵饱和沉淀方法所需设备简单，便于实际操作，使用最多，但其缺点是：加入过多硫酸铵以后溶液体积显著增加，所需硫酸铵的量很大,增加处理成本；沉淀得到的样品需要除盐，耗时耗力。超滤杯浓缩的方法，浓缩效率高，但是其设备比较昂贵，加之胞外表达的发酵液含有培养基成份和细胞代谢产物，容易堵塞超滤膜，这些缺点也影响了其广泛的使用。

因此亟需一种成本低、浓缩效率高、操作简单的浓缩酵母发酵液中蛋白的方法。

发明内容

针对硫酸铵饱和沉淀和超滤杯浓缩蛋白存在的不足之处，本发明提供了一种浓缩酵母发酵液中蛋白的方法，具体是利用疏水重力柱浓缩发酵液中的目标蛋白。

本发明所述的浓缩酵母发酵液中蛋白的方法包括如下步骤：

(1)重力柱填充：将与重力柱相适应的滤膜装填在重力柱底部，加入疏水介质高载量苯基疏水色谱柱料，并用超纯水洗脱介质中的乙醇；

(2)重力柱平衡：用1.5-3倍柱体积的硫酸铵平衡缓冲溶液对重力柱进行平衡；

(3)发酵液挂柱：向发酵液上清加入硫酸铵固体或者饱和硫酸铵溶液，使发酵液上清中的硫酸铵终浓度为1-1.7M，将柱体积6-8倍的发酵液上清溶液加入平衡后的重力柱中，至含有硫酸铵的发酵液自行流出重力柱；

(4)杂质蛋白洗脱：待发酵液挂柱后，用2-3倍柱体积硫酸铵平衡缓冲溶液洗脱挂柱发酵液中的杂质蛋白，直至洗脱液中检测不到杂质蛋白；

(5)目标蛋白收集：杂质蛋白洗脱后，加入4倍柱体积的洗脱液对目标蛋白进行洗脱，洗脱过程中，检测洗脱液目标蛋白质的活性，并收集具有目标蛋白活性的溶液。

上述高载量苯基疏水色谱柱料的介质大小为90μm，设计流速为200～400cm/h。

步骤(2)和(4)中所述硫酸铵平衡缓冲溶为pH 7.0-8.0，1-1.7M硫酸铵溶液(用氨水调节pH)，且硫酸铵浓度和步骤(3)所述的发酵液上清中的硫酸铵溶液的pH值、浓度保持一致。硫酸铵的浓度越大，蛋白的吸附能力越强，减小硫酸铵的浓度能节约成本。

步骤(5)中所述洗脱液为无盐或者低盐的溶液，常用的有：pH为7.5-8.5、成分为25mM的Tris-HCl溶液和pH为5.7-7.6、成分为20mM的磷酸盐缓冲溶液等。

本发明所述的浓缩酵母发酵液中蛋白的方法与现有技术相比有以下优点：

1)本发明方法可以根据样品体积，装填不同体积的重力柱，既可以用于小量分析，也可用于实验室小量制备，还能够放大重力柱体积，用于工业生产。