[发明专利]快速鉴定兰属植物的方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种快速鉴定兰属植物的方法，属于植物鉴定技术领域。

背景技术

20世纪末，兰花业发展迅速。栽培群体迅速扩大，新品种层出不穷。品种分类方面仍以传统瓣型分类为主，现代新兴技术和手段也有所尝试。运用数量分类方法对中兰花品种分类的研究，R分析初步得出了兰花花种级分类的特征性状和品种分类特征性状，Q分析得出了兰花花种级分类界线和类型分级界线。这是兰花品种分类运用现代技术取得的最大成果，也对经典形态分类提供了有力的佐证。国际上，有关兰花品种分类的工作非常少，仅限于日本和韩国方面。其现有兰花品种中有多数均为中国原有品种；品种分类也是对中国传统瓣型分类的延续。同时，随80年代后中国南方多省对兰花叶艺观赏的兴起，日本、韩兰花花界人士对兰花叶艺类别的说明多见，但作为非主流分类方法，并未有相关系统分类出现。目前，尚无系统全面的对莲瓣兰品种分类研究的相关报道。

自二十世纪90年代以来，植物分子系统学蓬勃发展，其理论和方法已日益成熟和完善，相对于形态性状，特别是数量性状，分子标记和DNA测序有许多无可比拟的优点。生物大分子本身就是遗传进化信息的载体和进化历史的累积，信息量大，其变异一般不易受环境影响而相对稳定，趋同效应弱，所提供的系统进化信息更接近客观自然，所揭示系统发育关系也更具客观性和可比性。基于基因和DNA片段变异或者序列碱基变异位点检测值为基因组的遗传变异，并根据所提供的信息进行系统发育分析已成为目前植物系统学研究的主要手段，广泛地应用于植物系统的各级分类单元上，并取得了重要的研究成果。

SCAR分子标记是一种快速、稳定、准确鉴定植物不同品种的新方法。SCAR标记是以品种的特异序列为基础，通过对特异序列设计引物，其PCR结果是一种显性标记，在电泳图谱上一般表现为特异片断的有无。SCAR标记应用于品种鉴别时仅需从标准样品中选择阳性和阴性两个品种作为对照即可。

发明内容

本发明目的在于提供一种通过SCAR标记，得到兰属植物DNA特异条带，用以快速鉴定兰属植物的方法。

一种快速鉴定兰属植物的方法，其特征在于通过植物基因组DNA的CTAB法提取兰属植物基因组DNA，通过兰属植物的随机引物BS-5的RAPD扩增反应，以及SCAR标记引物的PCR扩增反应，通过电泳检测观测扩增后的PCR产物条带，兰属植物样品都具有约1070bp的特异性条带。

所述的随机引物BS-5的RAPD扩增反应引物序列为：

BS-5：5'-TGCGCCCTTC-3'。

所述的SCAR标记引物的PCR扩增反应引物序列为：

SF:5'-TGCGCCCTTCCATCACCTT-3'

SW:5'-TGCGCCCTTCAATATTTTAAAGAA-3'。

本发明快速鉴定兰属植物的方法，具体通过下列步骤实现：

一.提取兰属植物基因组DNA

1）提取DNA所用的提取液，吸头，离心管等需要在高压灭菌锅中121℃(约1.1㎏/cm）高压灭菌20min；

2）取50㎎新鲜的叶片用液氮研磨，磨碎后置于1.5ml离心管中，加入预热的600μL2×CTAB缓冲液（100mMTris-Hcl,pH=8.0；20mMEDTA,PH=8.0；1.4MNaCl；2%CTAB；2%β-巯基乙醇；5%PVP）；

3）65℃温浴1h，每隔10min轻缓颠倒离心管，使其混匀；

4）12,000rpm/min离心10min，上清液转入另一干净离心管中；

5）分别用等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），氯仿：异戊醇（24:1）各抽提一次。12,000rpm/min离心10min；

6）上清液转管，加入等体积的冷的异丙醇，-20℃沉淀2h；

7）12,000rpm/min离心10min，弃上清液；

8）沉淀分别用70%乙醇，无水乙醇各洗涤一次；

9）将沉淀置于超净工作台上吹干，加入50μL1xTE（10mMTris-Hcl,pH=8.0；

1mMEDTA）溶解，放在-20℃备用。

二．SCAR标记的兰属特异片段的扩增

1）随机引物BS-5的RAPD扩增反应

引物序列：

BS-5：5'-TGCGCCCTTC-3'

PCR反应体系25μL：

DNA模板1.0μL

TaqDNA聚合酶(5U/μL，Takara)0.25μL

2.5mmol/LdNTPs2.0μL