[发明专利]一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法。

背景技术

链霉菌（Streptomyces）在分类学上属于原核生物界、放线菌目、链霉菌科，是一类具有分枝丝状体的好氧革兰氏阳性细菌，是土壤中主要的微生物类群之一。链霉菌基因组平均大小为8000kb，约为大肠杆菌基因组的两倍。同其它生物相比，其基因组最大特征之一就是其DNA具有极高的G+Cmol%，可高达69~78%，是迄今为止已知的G+Cmol%含量最高的生物类群之一。链霉菌是工业微生物中最具有商用价值的类群之一。人们已经了解到自然界中有近70%的抗生素是由链霉菌及其近缘放线菌产生的。自1928年AlexanderFleming发现第一个抗生素──青霉素以来，数以万计的抗生素正源源不断地被人们发现和创造出来并造福于人类。

作为活性天然产物重要来源的陆生微生物随着研究的不断扩展与深入，其生物多样性及相应的结构、活性多样性已逐渐被人们所认识，但作为生物起源和覆盖地球表面约70%的海洋中所蕴藏的微生物却知之甚少。由于海洋微生物所处的海洋是一个十分独特的环境，具有高盐、高碱、低温的特点，导致了微生物类群的多样性和微生物基因资源的多样性。目前已培养的微生物只占所有微生物的0.1％到1％，因此丰富的海洋生物资源无疑是天然药物筛选的重要来源。据报道，美国国立肿瘤研究所每年筛选新的抗癌化合物中有5%来自海洋生物，从海洋生物提取的化合物有10%具有抗癌活性。因此，基于海洋微生物的活性天然产物生物合成途径的探索和发现是新药开发的重要补充和延伸。

海洋微生物中的一个重要群体就是专属性海洋放线菌。1991年Fenical等发现了第一个依赖海水生长的特殊放线菌家族并将其命名为“MAR1”。2005年，结合全面的形态学特征分析和基因组测序分析后，“MAR1”被鉴定为第一个专属性海洋放线菌，并正式更名为“Salinispora”。随后，Demequina、Marinispora、Solwaraspora、Lamerjespora、Serinicoccus、Salinibacterium、Aeromicrobium、Willamsia、Marinactinospora以及Sciscionella等放线菌属相继被分离鉴定为专属性海洋放线菌。其中，海洋放线菌SalinisporaarenlocolaCNS-205就是专属性海洋放线菌Salinispora的代表性菌株。海洋放线菌SalinisporaarenlocolaCNS-205分布广泛，由于其生活环境的特殊性，该菌产生多种活性多样、结构新颖次生代谢产物，成为了新药开发研究的新资源。然而其生物合成机制却一直未被揭示。现有技术中尚未有关于海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，旨在解决现有技术中尚未有关于海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法的问题。

本发明的技术方案如下：

一种海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，包括步骤：

A、将已灭菌的SFMS培养基融化，温度降至40~50℃，在SFMS培养基中加入适量的抗生素，倒平板，将SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子悬液涂布平板，25~30℃培养4~5d；

B、将整合型质粒通过CaCl₂法导入供体菌中，借助于供体菌上tra基因，所述整合型质粒以接合转移方式从供体菌导入到步骤A得到的SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子中进行整合。

所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤A中，所述抗生素为阿泊拉霉素。

所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤B中，所述整合型质粒为pSET152和pIB139。

所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤B中，所述供体菌为pUZ8002。

所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤B中，供体菌与受体菌SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子的比例为（15~1）:1。

所述的海洋放线菌基因遗传操作系统的构建方法，其中，所述步骤B中，供体菌与受体菌SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子的比例为8:1。