[发明专利]一种人皮肤干细胞活力素的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种人皮肤干细胞活力素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、皮肤干细胞的获取：取来源于健康新生儿或小儿的包皮组织，经磁珠筛选法筛选出皮肤干细胞；

S2、皮肤干细胞的接种培养

将得到的皮肤干细胞接种在饲养层细胞上，传代扩增培养；

S3、人皮肤干细胞活力素的获得

待皮肤干细胞进行传代扩增到2-10倍后，胰酶消化、离心，收集上清液，获得人皮肤干细胞活力素。

2.根据权利要求1所述的人皮肤干细胞活力素的制备方法，其特征在于，所述皮肤干细胞来源于包皮的全厚皮肤，即皮下组织剪除后的包皮皮片。

3.根据权利要求1所述的人皮肤干细胞活力素的制备方法，其特征在于，皮肤干细胞的获取具体为：取健康的新生儿或小儿包皮环切术切除的包皮组织，置于含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的PBS中，并经PBS反复漂洗后，剪取包皮的全厚皮肤，即皮下组织剪除后的包皮皮片，PBS漂洗两次，放入0.25%Trypsin-EDTA中，剪碎，37℃消化30min，用200目过滤网过滤细胞，收集滤液；在得到的滤液中加入含有10%FBS的DMEM/F-12完全培养基，终止反应，反复吹打，用磁珠筛选法筛选出皮肤干细胞。

4.根据权利要求1所述的人皮肤干细胞活力素的制备方法，其特征在于，皮肤干细胞的接种培养具体为：将得到的皮肤干细胞在转速为1200-1500r/min的条件下离心5min，用DMEM/F-12完全培养基洗皮肤干细胞1次，调整细胞密度以2~5x10⁴个/cm²密度将皮肤干细胞接种在饲养层细胞上，用DMEM/F-12完全培养基，37℃、5%CO₂、90%湿度下传代扩增培养。

5.根据权利要求1所述的人皮肤干细胞活力素的制备方法，其特征在于，所述饲养层细胞的制备方法包括以下步骤：

S11、将终浓度为0.25μg/ml丝裂霉素C加至接近汇合的人成纤维细胞中，37℃过夜，更换DMEM/F-12完全培养基；

S12、0.25%Trypsin-EDTA消化，悬液1x10⁷个/ml中加入丝裂霉素C，终浓度为20μg/ml，37℃孵育1h，离心清洗去除丝裂霉素C，再以1x10⁵个/ml的人成纤维细胞进行接种；

S13、再培养1~3d后，0.25%Trypsin-EDTA消化，再接种在新的DMEM/F-12完全培养基中，接种浓度5x10⁵个/ml或10⁴个细胞/cm²；

S14、继续培养1~2d，进行皮肤干细胞接种。

6.根据权利要求5所述的人皮肤干细胞活力素的制备方法，其特征在于，接近汇合的人成纤维细胞的浓度为1x10⁵个/ml。

7.由权利要求1-6任一项的方法制备的人皮肤干细胞活力素。

8.权利要求7所述人皮肤干细胞活力素用于制备化妆品的用途。

9.权利要求8所述的人皮肤干细胞活力素在化妆品上的应用，其特征在于，以冻干粉的形式应用，该冻干粉的保护剂为含量为0.2%－5%海藻糖，溶媒为生理盐水或PBS中的至少一种，按个人实际情况，确定施用本品方式及用量。

10.权利要求8所述的人皮肤干细胞活力素在化妆品上的应用，其特征在于，应用于精华液，该精华液的稳定保护剂为海藻糖；保湿增稠剂为聚谷氨酸、辅酶Q10以及透明质酸中的至少一种。