[发明专利]基因工程菌株筑波链霉菌L21及其应用

说明书

本发明提供一种基因工程菌株筑波链霉菌L21（Streptomyces tsukubaensis L21），该菌保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2015年8月19日，保藏号：CGMCC NO.11253。本发明提供的菌株遗传性状和发酵单位较稳定，培养和发酵条件适合于工业化生产，发酵单位高。本发明通过基因工程提高他克莫司生物合成途径中的特异性调控基因的拷贝数，作为基因改造他克莫司生物合成途径中的限速酶以提高他克莫司的产量，以降低工业化生产过程的成本，将他克莫司的发酵单位提高至945 m g/L。

技术领域

本发明属生物工程领域，涉及微生物制药领域中的基因工程菌株筑波链霉菌L21及其培养方法。

背景技术

他克莫司（Tacrolimus）又名FK506，是从链霉菌属（streptomyces）中分离出的发酵产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。具有很强的免疫抑制剂活性和抗真菌活性，在临床上主要是用于治疗器官移植后的免疫排斥反应和治疗皮肤炎症等。作为一种强力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介素-2（L-2）的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，较环孢素（CsA）强100倍。近年来，作为肝、肾移植的一线用药，已在日本、美国等14个国家上市。临床实验表明，其在心、肺、肠、骨髓等移植中应用有很好的疗效。同时FK506在治疗特应性皮炎（AD）、系统性红斑狼疮（SLE）、自身免疫性眼病等自身免疫性疾病中也发挥着积极的作用。

现在发现生产他克莫司的链霉菌有很多，有些遗传性状和发酵单位较稳定，培养和发酵条件适合于工业化生产，但是菌株的发酵单位较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因工程菌株筑波链霉菌L21，所述菌命名为筑波链霉菌L21（Streptomyces tsukubaensis L21），与中国发明专利（CN200810019003.4）中链霉菌YN06-1593相比，他克莫司产量提高了72%。该菌保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏日：2015年8月19日，保藏号：CGMCC No. 11253，保藏地址：北京市朝阳市北辰西路1号院3号。

所述的基因工程菌株筑波链霉菌L21具有较高拷贝数的SEQ ID NO 1的核苷酸序列，该核苷酸序列编码一个他克莫司生物合成的转录调控因子，对他克莫司的生物合成至关重要。在基因工程菌株筑波链霉菌L21中，将该调控因子的编码基因进行高表达。

本发明的另一个目的是提供所述筑波链霉菌L21在他克莫司生物合成中的应用。该菌株连续多次在斜面培养基传代，经种子培养基和发酵培养基进行发酵实验验证，通过高效液相色谱测定菌丝和发酵液中他克莫司的产量，并与中国发明专利（CN200810019003.4）中链霉菌YN06-1593进行比较。结果显示L21的遗传性状稳定，他克莫司发酵单位可达到945 m g/L。

本发明提供的一种基因工程菌株筑波链霉菌L21，通过以下步骤培养获得他克莫司：

（1）固体培养：把筑波链霉菌L21接种于ISP4固体培养基中，于28℃培养箱中培养7天；

（2）液体培养：固体培养后，将菌丝体接种于种子培养基中，在28℃摇床上培养24h，250rpm，种子培养基24h后接种至发酵培养基中，接种量10%，在28℃摇床上发酵培养96h后分析检测他克莫司。

所述的ISP4固体培养基为：淀粉1%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.1%，碳酸钙0.2%，硫酸铵0.1%，琼脂2%，所述百分含量均为质量百分含量。

所述的种子培养基为：淀粉2%，糊精1%，肉胨3%，碳酸钙0.2%，其余为水，pH 6.8，所述百分含量均为质量百分含量。