[发明专利]一种高表达克氏原螯虾ATP合酶F0亚基8的基因工程菌在审
申请号: | 201510664978.2 | 申请日: | 2015-10-15 |
公开(公告)号: | CN105200001A | 公开(公告)日: | 2015-12-30 |
发明(设计)人: | 水燕;周鑫;徐增洪;沈怀舜;廖元元 | 申请(专利权)人: | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 |
主分类号: | C12N1/21 | 分类号: | C12N1/21;C12N15/70;C12N9/14;C12R1/19 |
代理公司: | 无锡华源专利商标事务所(普通合伙) 32228 | 代理人: | 冯智文 |
地址: | 214081 江*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 表达 克氏原螯虾 atp f0 基因工程 | ||
1.一种高效表达克氏原螯虾ATP合酶F0亚基8蛋白的基因工程菌,是将atp8基因导入E.coliBL21(DE3)得到的基因工程菌。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述atp8基因的核苷酸序列如GeneBank中SequenceID:AFQ31580的序列所示。
3.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法,其步骤如下:
(1)设计引物atp8-1:(5′-TCAGGAGGTACCATGCCTCAAATATCCCCTCT-3′)和atp8-2:(5′-ACTGAGAAGCTTTTATCATTTTCAAATTTTCTCAATC-3′),利用PCR将克氏原螯虾ATP合酶F0亚基8的基因atp8的cDNA编码框5’和3’两侧分别引入KpnΙ和HindIII限制性酶切位点;
(2)通过双酶切、分子连接等基因操作将atp8基因插入到表达质粒pColdII,构建重组质粒pColdII-atp8;
(3)随后将pColdII-atp8转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化子并进行测序验证;
所述限制性酶切位点以加下划线的字母表示。
4.一种以权利要求1所述基因工程菌生产ATP合酶F0亚基8蛋白的方法,其步骤如下:将重组表达质粒pColdII-atp8转化大肠杆菌BL21(DE3)。含重组质粒的工程菌在37℃条件下剧烈震荡培养至OD600≈0.5,随后转入15℃培养并加入终浓度为0.4mM的IPTG,诱导表达24h,转速160rpm。收集菌体,SDS-PAGE分析全菌总蛋白显示,基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带,条带分子量与预期大小分子量~7kD一致。在此条件下,重组ATP合酶F0亚基8蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的15%,全为可溶性状态。
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