[发明专利]融合铁蛋白在疫苗和其他方面的应用

说明书

本申请是2003年5月12日递交的申请号为03813504.3，发明名称为“融合铁蛋白在疫苗和其他方面的应用”的分案申请。

相关申请

本专利申请拥有60,379,145号美国临时专利的权益，60,379,145号临时专利申请于2002年5月10日提交，该专利申请的全文在此通过引证被并入本文。

发明领域

本发明通常涉及融合铁蛋白，特别是在铁蛋白内部和外部的N端和/或C端融合其他蛋白或肽片段形成能够自组装的融合蛋白，以及该类融合蛋白在作为疫苗和其他方面的应用，包括运输氧气以及治疗性导入药物和其他治疗药剂。

发明背景

铁蛋白含有高度保守的24个亚基，这些亚基存在于所有的动物、细菌和植物中。铁蛋白的主要生理作用是控制多核Fe(III)₂O₃形成的速度和定位。(见Theil，E.C.等人在《Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.》上发表的文章，1990，63：421-449；Harrison，P.M.，Lilley，T.H.等人在LoehrT.M.编著的《Weinheim：VCH》中的文章，1990，33-452)该控制作用是通过生物矿化作用，将水合铁离子和质子运进和运出含无机物的内核实现的。通过这一机制使铁蛋白积累的铁离子强度大于生理状态下可溶性的游离铁离子强度。生物矿化作用的速度直接与每个铁蛋白颗粒内的H亚基和L亚基(即所谓的轻链和重链)的比例相关，H亚基含量增加时表现出铁离子储存速度增加的趋势。蛋白颗粒的组成差异具有组织特异性，并影响铁的氧化代谢、核心形成和铁循环的机制。比如，血清中的铁蛋白主要由L链组成，来自于心脏的铁蛋白H链含量较高。铁蛋白矿化核心为不同的氧化酶提供铁离子，而且起到还原的作用。

每个铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基含有432个对称体，直径125埃，颗粒厚度约为25埃，中空的内部核心直径约为80埃(图1)。典型的铁蛋白单体含有至少两个异构体，由H链和L链组成，二者在氨基酸序列上不同。在许多脊椎动物包括人中已经确定H亚基和L亚基的长度，这两种结构体通常存在于已经确证的铁蛋白中。每个铁蛋白亚基分子量大约为17道尔顿，具有束状螺旋的拓扑结构，包含4个反向平行螺旋基序和一个短螺旋(C端螺旋)，该螺旋大致与第4个束状螺旋的长轴垂直。依据惯例从N端开始分别将螺旋标记为“A，B，C，D和E”。N端序列与颗粒第3个折叠轴相邻并明显延伸到颗粒表面，而E螺旋与第4个折叠轴挤压在一起，其C端延伸到颗粒核心。挤压的结果是在蛋白颗粒表面形成2个孔。位于第四个折叠的孔大约有4-5埃，主要为疏水性；而位于第三个折叠的孔直径略大，是6.0埃，主要为亲水性。这两个孔或其中一个可能是水合铁离子扩散出入颗粒的通道。

以前关于铁蛋白的研究工作，如5,248,589；5,358,722和5,304,382号美国专利，通过引证被并入本文均列在参考文献中，主要集中在蛋白外壳和内核的生理作用方面，如除了含铁水合物以外的物质可能定位于壳内。通过差示扫描量热法研究显示(见SPMartsev，APVlasov，PArosio，等人在《ProterinEngineering》发表的文章，1998，11，377-381)重组人L和H铁蛋白在pH2.0到2.8之间时解离成亚基单体。

其他方面的工作包括使用病毒样颗粒作为疫苗的结构模型，在缺少佐剂的的情况下诱导产生抗体反应，保护免受病毒感染和过敏反应(见Lechner等人在《Intervirology》发表的文章，2002，212-217，45(4-6))，但该系统不包括以铁蛋白为基础的蛋白开发系统。在Marchenko等人在2003年《J.Mol.MicrobiolBiotechnol》5(2)：97-104页发表的文章中，已知蛋白P1-380能够形成病毒样颗粒(VLP)。在该研究中，P1-380蛋白的C端和/或N端融合后不影响VLP的自组装，具有双功能的融合蛋白颗粒显示出诱导更强免疫反应的能力。Douglas等人还进行了以下研究：一种形成铁离子核的蛋白与豇豆花叶病毒(CCMV)相连，具体参考发表在《Adv.Mater.》上的文章，2002，14(6)，415-418页。其他的融合蛋白还有包含与乳头瘤病毒非结构蛋白L2，一种次要结构蛋白，融合形成的病毒样颗粒的嵌合蛋白，具体参考Greenstone等人在《PNASUSA》上发表的文章，1998，95(4)，1800-1805页。但是以上所有的融合蛋白中都不包括铁蛋白。