[发明专利]一种绿原酸完全抗原及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种绿原酸完全抗原及其制备方法和应用。

背景技术

绿原酸(Chlorogenicacid,CGA)是一种重要的中药小分子活性成分，广泛存在于杜仲科、忍冬科忍冬属和菊科嵩属植物中。绿原酸在茵陈、菊花、金银花、忍冬藤、鱼腥草、栀子、蒲公英和小蓟等中药材中含量较高，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、清除自由基、调节血糖和兴奋中枢神经系统等多种生物活性，长期以来备受科学界关注，因此，寻找合适的绿原酸含量测定方法，成为这类中药材质量研究的重要环节。

高效液相色谱法(HPLC)是目前常用的绿原酸含量的检测方法，但HPLC法需要大型仪器且样品前处理复杂，因此具有局限性。免疫学分析方法灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简单，还可以进行高通量检测，成为生物医药领域的重要检测方法。但绿原酸属于小分子半抗原，具有反应原性但不具备免疫原性，不能直接刺激机体产生免疫反应。为了建立绿原酸定量分析的免疫学分析方法，有必要提供一种绿原酸完全抗原及其制备方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种绿原酸完全抗原，解决了上述技术问题；本发明还提供了一种绿原酸完全抗原的制备方法，该制备方法简单易操作，可以进行大规模生产；本发明还提供了该绿原酸完全抗原的应用。

本发明第一方面提供了一种绿原酸完全抗原，所述绿原酸完全抗原为绿原酸通过化学键与载体蛋白连接形成的复合物。

优选地，所述绿原酸与所述载体蛋白的摩尔比为10-200:1。

优选地，所述绿原酸完全抗原的结构式如P1所示：

式中，n为10-200，R为载体蛋白。

n为所述绿原酸完全抗原中所述绿原酸与所述载体蛋白的偶联比。

也可简写为

更优选地，所述载体蛋白为球蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、兔丙种球蛋白或鸡的丙种球蛋白。

所述绿原酸分子和载体蛋白的偶联比n的取值范围为10-200，即每个载体蛋白分子上连接的绿原酸分子的平均数目为10-200，在该偶联比下得到的绿原酸完全抗原既不影响绿原酸分子的空间结构，使其具有良好的免疫原性，从而有利于将本发明的绿原酸完全抗原应用于各种免疫层析检测试剂盒中。

更优选地，n为10-20，该偶联比下得到的绿原酸完全抗原具有良好的免疫活性，适合用作免疫抗原制备抗体，制得的抗体效价良好，对绿原酸具有良好的识别检测性能。

本发明第一方面提供的绿原酸完全抗原为绿原酸通过化学键与载体蛋白连接形成的复合物，可用于特异性绿原酸抗体的制备，以该绿原酸完全抗原为免疫原制备的单克隆抗体和多克隆抗体对绿原酸具有较高的特异性和灵敏性，可以满足绿原酸免疫学分析方法建立的需要。

本发明第二方面提供了一种绿原酸完全抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)将绿原酸、二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于溶剂中，在室温条件下搅拌反应2-8h，制得第一反应液；所述绿原酸、所述二环己基碳二亚胺和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2-5:2-5；

(2)将载体蛋白溶于缓冲液中，制得第二反应液；

(3)将所述第一反应液滴加到所述第二反应液中，在室温条件下轻轻搅拌，反应2-8h，得到含有绿原酸完全抗原的混合液，经透析后，制得绿原酸完全抗原；所述绿原酸完全抗原为所述绿原酸通过化学键与所述载体蛋白连接形成的复合物。

优选地，步骤(3)中所述绿原酸与所述载体蛋白的摩尔比为10-200:1。

优选地，所述绿原酸完全抗原的结构式如P1所示：

式中，n为10-200，R为载体蛋白。

更优选地，所述n为10-20。

更优选地，所述载体蛋白为球蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原、兔丙种球蛋白或鸡的丙种球蛋白。

优选地，步骤(1)中所述溶剂为二甲基甲酰胺(DMF)。

优选地，步骤(2)中，所述缓冲液为pH为9.6的碳酸盐缓冲液。

优选地，步骤(3)中，所述透析的方法为：将所述含有绿原酸完全抗原的混合液转入透析袋中，然后将所述透析袋置于2LpH7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，4℃轻轻搅拌，透析72h，收集所述透析袋中的液体，即得所述绿原酸完全抗原，将所述绿原酸完全抗原与等体积的甘油混合，分装后-20℃保存。